李继睿，禹练英，杨孝辉，郭君

（湖南化工职业技术学院，湖南 株洲 412004）

野菊花为菊科多年生草本植物野菊的头状花序，外形与菊花相似，野生于山坡草地、田边路旁。以色黄无梗、完整、气香、花未全开者为佳。野菊花中含有菊醇（chrysol）、菊酮（chrysanthenone）、α-蒎烯、樟脑、龙脑、樟烯等，尚含野菊花内酯（yejunualactone）、野菊花素A（artoglasin-A）、刺槐甙（acaciin）、蒙花甙（linarin）、菊甙、木犀草素、蒙花苷（linarin）、绿原酸（chlorogenic acid）、香草酸（vanillic acid）等[1-3]。

绿原酸具有广泛的生物活性，是一种有效的酚型抗氧化剂，可以消除羟基自由基和超氧阴离子等自由基的活性，从而保护组织免受氧化作用的损害。可以保护胶原蛋白不受活性氧等自由基的破坏并能有效防止紫外线对人体皮肤的伤害作用。绿原酸在防癌、抗癌、创伤的治愈、皮肤健康湿润、润滑关节、防止炎症以及体内血糖的平衡调控等方面都有一定的疗效。对多种致病菌和病毒有较强的抑制和杀灭作用。绿原酸有降血压、抗病毒、抗菌、增高白血球、消炎、预防糖尿病、显著增加胃肠蠕动和促进胃液分泌等作用。因此，在食品、保健、医药和日用化工等领域得到了广泛的应用[4-11]。

绿原酸分子结构中由于具有酯键、不饱和双键及多元酚等不稳定部分，提取过程中，通过水解和分子内酯基迁移而容易发生异构化。因此，可以利用乙醇、丙酮、甲醇等极性溶剂从植物中提取绿原酸，常用提取方法有醇溶法、水提醇沉、醇提铅沉、石灰乳沉淀法、聚酰胺柱层析法及超临界萃取法等[12-14]。但是由于绿原酸本身的不稳定性，提取时不能高温、强光及长时间加热，因此采用超临界流体萃取法提取是一种较为理想的方法[15-16]。

本文对超临界流体萃取法提取野菊花中绿原酸的工艺进行探讨，并利用正交试验法对工艺条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野菊花：市售；无水乙醇（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；绿原酸对照品：南京替斯艾么中药研究所。

1.2 仪器与设备

UV-1801型紫外可见分光光度计：北京仪器有限公司；超临界流体萃取装置：江苏华安超临界有限公司。

1.3 方法

1.3.1 正交试验方案

根据文献报道及天然产物的提取经验，确定考察因素为萃取压力A、萃取时间B、萃取温度C。分别取3个水平进行考察。考察因素及水平见表1，采用正交试验表L9（34）设计试验方案，以绿原酸得率作为考察参数。

表1 超临界萃取因素及水平Table 1 Factors and levels of supercritical extraction(SPE)

1.3.2 工艺流程

综合考虑提取效果和经济效益，固定萃取次数为1次，按上述正交试验方案进行实验。将野菊花于烘箱中烘干3 h，再将干野菊花用粉碎机磨碎。称取100 g野菊花粉，加20 mL蒸馏水作为浸提助剂，装入萃取斧中萃取一定时间，分离得到粗提物。工艺流程：野菊花花蕾→烘干→细粉→超临界流体萃取→过滤→绿原酸提取液。

2 结果与讨论

2.1 绿原酸含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备

准确称取绿原酸对照品6.3 mg，置于50 mL容量瓶中，用70%的乙醇溶液溶解，定容即得[11-12]。

2.1.2 测定波长的选择

取对照品溶液5.00 mL，置于50 mL容量瓶中，用70%的乙醇溶液，定容即得。以70%的乙醇溶液为参比液，于紫外分光光度计上在200 nm～400 nm范围内进行光谱扫描，吸收曲线见图1。

结果表明在331.0 nm处有最大吸收峰，故选择331.0 nm作为绿原酸的测定波长。

2.1.3 标准曲线的绘制

图1 绿原酸对照品的吸收光谱曲线（ρ=12.6μg/mL）Fig.1 The absorption spectrum of chlorogenic acid standard

准确吸取对照品溶液 0.00、2.50、5.00、7.50、10.00 mL于5个50 mL容量瓶，用70%的乙醇定容。于紫外可见分光光度计上在λ=331.0 nm处测定吸光度（A），所得数据见表2。

表2 绿原酸对照品的测定结果Table 2 Determination results of chlorogenic acid contrast product

以吸光度A为纵坐标，绿原酸浓度C为横坐标绘制标准曲线，R=0.9999。绿原酸对照品的工作曲线见图2。

2.1.4 样品的处理和测定

2.1.4.1 野菊花的测定

准确称取干燥野菊花样品1.0 g，置回流提取装置中，加入70%的乙醇25 mL提取1 h，过滤，残渣同样方法回流提取0.5 h，过滤，残渣分别用10 mL 70%的乙醇洗涤2次，合并各溶液于100mL容量瓶中，用70%的乙醇定容至刻度，摇匀备用。取样品溶液1 mL于50 mL容量瓶中，以70%的乙醇定容，摇匀后于331.0nm处测定吸光度（A），根据工作曲线计算出绿原酸的含量，所得数据见表3。

2.1.4.2 提取液测定

取绿原酸提取液，以70%的乙醇作溶剂稀释，过滤，将滤液以70%的乙醇定容至100 mL。取各试样0.5 mL于50 mL的容量瓶中用70%的乙醇作溶剂定容，待测。根据绿原酸对照品的工作曲线，计算样品中绿原酸的质量分数。

表3 野菊花中绿原酸的含量Fig.3 The content of chlorogenic in wild chrysanthemum flower

2.2 萃取条件实验结果

按照表1设计的因素水平根据正交表L9（34）进行实验，结果见表4。

表4 正交试验结果Table 4 Results of L9(33)level orthogonal test

由表4可知，超临界CO2流体萃取法的最佳提取条件为A1B3C3，即在萃取压力为25MPa、萃取温度为50℃、萃取时间3h。在此条件下，绿原酸得率达到0.4883%。从极差分析知在所设计的实验方案范围内，各因素对绿原酸提取的影响大小顺序分别是萃取时间＞萃取温度＞萃取压力。

2.3 验证实验

按最佳工艺条件A1B3C3进行验证实验，4次实验平均结果为绿原酸得率为0.512%，实验结果较为理想，说明该工艺条件简单、稳定、可行。

3 结论

通过正交试验，确定了超临界CO2流体萃取法的最佳提取条件为：在萃取压力为25 MPa，萃取温度为50℃下萃取3 h。在此条件下，绿原酸得率达到0.4883%。

CO2在超临界状态下对有机物有特殊增加的溶解度，而低于临界状态下有机物基本不溶解的特性，将CO2流体不断在萃取釜和分离釜间循环，从而有效地将需要分离提取的绿原酸分离出来。

超临界CO2流体萃取法提取绿原酸尚未应用于工业化生产，其原因：（1）分离过程在高压下进行，设备一次性投资大；（2）萃取釜无法连续操作，造成装置的时空产率比较低；（3）过程消耗不容忽视，超临界CO2流体萃取技术的开发，应充分考虑其经济性。

绿原酸活性强，清热解毒功能显著，是替代化学抗生素的植物药提取物。随着中药现代化进程的加快和世界对中药提取物需求量的增大，产品有巨大的市场空间和创汇潜力，因此，开发利用绿原酸这种宝贵的植物资源具有重要的意义。

[1]高美华.野菊花化学成分的研究[J].中药材,2008(5):682-684

[2]卢化,朱丽.菊花类商品中绿原酸的含量比较[J].湖北中医学院学报,2010(1):30-32

[3]黄美娥,卓儒洞,晏丽.4种堇菜科植物中绿原酸含量的比较[J].安徽农业科学,2009(34):16851-16852

[4]吴江涛.绿原酸的生物活性及其应用[J].现代农业科技,2009(19):13997-14037

[5]朱燕.绿原酸的应用及其研究热点[J].农业工程技术:农产品加工业,2010(4):34-37

[6]刘军.绿原酸对抗乙肝病毒-HBsAg和HBeAg的抑制作用[J].解放军药学学报,2010(1):33-36

[7]陈娟娟.绿原酸体外抗人巨细胞病毒的实验研究[J].医药导报,2009(9):1138-1141

[8]陈少萍.绿原酸药代动力学研究进展[J].中成药,2010(4):645-648

[9]黄志卓,陈燕波,常翠青.氯原酸对高胰岛素与高油酸状态下HepG2细胞葡萄糖利用的影响[J].营养学报,2009(5):41-43

[10]葛建丹,陈媚,宋必卫.绿原酸跨细胞转运机制研究[J].中国药理学通报,2009(8):1094-1098

[11]胡克杰,王跃红,王栋.金银花中氯原酸在体外抗病毒作用的实验研究[J].中医药信息,2010(3):27-28

[12]向宁,李文芳.微波技术提取刺三加叶中绿原酸的研究[J].中国林副特产,2009(6):19-20

[13]阮浩,王宝峰,陈蕊.液固萃取法从烟叶中提取绿原酸的工艺研究[J].科技创新导报,2009(27):10-11

[14]符玲.野菊花中绿原酸的不同提取工艺比较[J].郑州大学学报:医学版,2010(3):499-501

[15]李国龙,李继睿,邵涛.超临界流体技术应用及进展[J].广州化工,2004(3):5-9

[16]谭伟.超声场对超临界CO2萃取葵粕绿原酸的影响[J].精细化工,2009(10):969-974