孙洁心，孙强，张永忠

（1.黑龙江农垦职业学院，黑龙江 哈尔滨 150025；2.东北农业大学应用化学系，黑龙江 哈尔滨 150030；3.教育部大豆生物学重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030）

大豆在用于食用油加工中产生的副产品豆粕数量可观，这些豆粕除少部分用于发酵酱油、生产大豆浓缩蛋白或分离蛋白外，绝大多数被用作饲料，造成了豆粕资源的极大浪费。而大豆中含有的微量生理活性物质大豆异黄酮绝大部分留在豆粕中而未被利用。

很多调查研究报道以及动物试验表明，大豆异黄酮具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地预防和抑制白血病、骨质疏松、结肠癌、肺癌、妇女更年期综合症等多种疾病的发生，尤其是对乳腺癌和前列腺癌有积极的预防和治疗作用[1]。一般认为苷元（主要是genistein和daidzein）是大豆异黄酮的主要活性组分。97%～99%的大豆异黄酮以糖苷形式存在，苷元形式仅为1%～3%[2]。

研究发现少孢根霉发酵豆粕可以使豆粕中绝大部分大豆异黄酮糖苷在β-葡萄糖苷酶的作用下水解为大豆异黄酮苷元[3]，发酵法制备大豆异黄酮苷元不但可以使产量大大增加，而且还可以降低成本，更具有吸引力的是能直接生产苷元，适合工业化生产[4]。因此从发酵豆粕中分离提取大豆异黄酮对于豆粕资源的综合利用和提高其附加值具有重要意义。本研究旨在通过单因素试验对于发酵豆粕中大豆异黄酮的提取条件进行优化，以期找到最佳的工艺参数，为发酵法生产大豆异黄酮提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

大豆豆粕：哈高科大豆食品有限责任公司。

1.2 菌种

少孢根霉（CCTCC AF 96004）由东北农业大学生命学院微生物实验室提供。

1.3 试剂

染料木黄酮、黄豆苷元、染料木苷和黄豆苷标准品：sigma公司；乙醇等为国产分析纯试剂。

1.4 仪器

UV-7500型紫外—可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；AL104型电子天平：上海天平仪器厂；H.H.S 21-2R型电热恒温水浴锅：上海医疗器械五厂；DH600A型恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.5 方法

1.5.1 三波长紫外分光光度法测定大豆异黄酮总含量

1.5.1.1 三波长的选择[5]

用紫外可见分光光度计对异黄酮提取液、染料木苷标准品溶液及干扰物溶液（纯化大豆异黄酮后的剩余液）在紫外区（190 nm～400 nm）进行扫描，采用作图法确定三波长的组合。

1.5.1.2 标准曲线的制作

准确称取染料木苷标准品1.0 mg溶解于95%乙醇中，并定容至 100 mL。分别取 3、6、9、12、15 mL 此溶液于25 mL容量瓶中定容至刻度。用UV-7500紫外可见分光光度计测定3个波长处的吸光度，计算△A。以染料木苷的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，用Excel软件处理，得回归标准曲线。

大豆异黄酮提取量/（μg/g）=提取液中大豆异黄酮总量（μg）/发酵所用豆粕量（g）

1.5.2 发酵豆粕的制备

少孢根霉发酵豆粕制备大豆异黄酮苷元的发酵培养基是豆粕∶水=1∶3，0.8%乳酸。发酵条件是发酵时间24 h，发酵温度30℃。通过实验得出此条件下黄豆苷元转化率为90.95%，染料木黄酮转化率为92.24%。

1.5.3 最佳提取条件的选择

以乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度、提取次数5个可能影响提取效果的影响因素做单因素试验，以确定各因素对发酵豆粕中大豆异黄酮提取量的影响作用，优化出最佳提取条件。

2 结果与分析

2.1 三波长的选择

测定大豆异黄酮的3个波长确定为λ1=240 nm、λ2=260 nm、λ3=280 nm。按三波长计算公式：

2.2 标准曲线的制作

用UV-7500紫外可见分光光度计分别在240、260、280 nm处测定不同浓度标准溶液的吸光度A240、A260、A280，计算吸光度△A。以△A为纵坐标，染料木苷浓度为横坐标，绘制标准曲线如图1所示。

2.3 最佳提取条件的确定

2.3.1 乙醇浓度的确定

接种少孢根霉于发酵培养基上，在恒温培养箱中30℃发酵培养24 h。分别用30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇在常温下、磁力搅拌条件下提取30 min，料液比200 g/L，提取2次，在4000 r/min离心并合并提取液，定容至50 mL，稀释后过滤，采用三波长紫外分光光度法测定总含量，结果如图2所示。

由图2可以看出，当乙醇浓度为60%时，大豆异黄酮提取总量最高，为2855.485μg/g。当乙醇浓度继续升高时，提取量反而降低。因此选择提取浓度为60%的乙醇。

2.3.2 料液比的确定

接种少孢根霉于发酵培养基，在恒温培养箱中30℃发酵培养 24 h。分别用 60%乙醇液料比 3∶1，4∶1，5∶1，6∶1 常温下、磁力搅拌的条件下提取 30 min，提取2次，在4000 r/min离心并合并提取液，定容至50 mL，稀释后过滤，采用三波长紫外分光光度法测定大豆异黄酮总含量，结果如图3所示。

由图3可以看出，随着料液比的升高，大豆异黄酮的提取量逐渐增加。在液料比为4∶1之后，大豆异黄酮的提取量增加不再明显。为了节约能源，采用液料比4∶1，即料液比200 g/L作为最佳提取料液比。

2.3.3 提取时间的确定

接种少孢根霉于发酵培养基，在恒温培养箱中30℃发酵培养24 h。用60%乙醇、料液比200 g/L，分别提取 30、60、120、180、240 min，在 4000 r/min 离心并合并提取液，定容至50 mL，稀释后过滤，采用三波长紫外分光光度法测定大豆异黄酮总含量，结果如图4所示。

由图4可以看出，在提取时间为60 min时，大豆异黄酮提取已较彻底，延长时间对于大豆异黄酮的提取总量影响不大。为了节省时间，采用60 min为最佳提取时间。

2.3.4 提取温度的确定

接种少孢根霉于发酵培养基，在恒温培养箱中30℃发酵培养24 h。用60%乙醇、料液比200 g/L，分别在室温，40、60、80 ℃下提取 60 min，在 4000 r/min离心并合并提取液，定容至50 mL，稀释后过滤，采用三波长紫外分光光度法测定大豆异黄酮总含量，结果如图5所示。

由图5可以看出，随着温度的升高，大豆异黄酮的提取总量反而降低。原因可能是高温条件下异黄酮苷元被氧化，详细原因有待进一步研究。因此选用室温作为最佳提取条件。

2.3.5 提取次数的确定

接种少孢根霉于发酵培养基，在恒温培养箱中30℃发酵培养24 h。用60%乙醇、料液比200 g/L，在室温条件下分别提取1、2、3次，提取时间60 min。在4000 r/min离心并合并提取液，定容至50 mL，稀释后过滤，采用三波长紫外分光光度法测定大豆异黄酮总含量，结果如图6所示。

由图6可以看出，提取次数对于大豆异黄酮提取量的影响不大。在提取次数为2时，提取已较完全。

3 结论

本试验通过单因素试验确定从发酵培养基中提取大豆异黄酮的最佳提取条件是：60%乙醇，料液比200 g/L，室温下提取60 min，提取2次。此条件下异黄酮提取总量为2855.485μg/g。微生物发酵豆粕制备大豆异黄酮苷元及其提取分离的研究，对综合利用豆粕资源、提高其附加值具有重要的意义。

[1]NaimM,Gestetner B,Zikah S.Soybean Isoflavones.Characterization,Determination and Antifungal Activity[J].J Agric Food Chem,1974,22:806-810

[2]Wang H J,Murphy P A.Isoflavone composition of American and Japanese soybeans in lowa:effects if variety crop year and location[J].Journal of agricultural and food chemistry,1994,42:1674-1677

[3]蒋大海,田娟娟,白志明.固态发酵法制备大豆异黄酮苷元[J].食品科学,2008,29(4):163-166

[4]井乐刚,张永忠.微生物发酵制备大豆异黄酮的研究进展[J].微生物学通报,2003,30(2):86-88

[5]魏福华,张永忠,井乐刚,等.紫外分光光度法测定大豆中大豆异黄酮[J].理化检验:化学分册,2004,42(6):461-463