刘 声，孙桂芝，雷 娜

(1.中国中医科学院广安门医院肿瘤科，北京 100053;2.山西中医学院中医系，太原 030024;3.北京振东光明药物研究院有限公司，北京 100120)

肿瘤的发生、发展与机体的免疫状态密切相关。近年来的国内外研究表明［1，2］，机体的炎性微环境在肿瘤转移中发挥着重要作用，并与调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)和辅助性 T细胞 17(T helper 17 cells，Th17)的表达与功能密切相关。在特定条件下，Treg细胞与Th17细胞受炎性细胞因子的影响会发生相互转化，调控Treg/Th17之间的平衡是逆转肿瘤转移过程中炎性内环境的关键环节。本文将探讨活血及益气活血中药代表苏木、苏木+黄芪对 Lewis肺癌荷瘤小鼠脾Th17、Treg细胞平衡及其相互间转化的转录分子的干预作用，为中药逆转肿瘤免疫逃逸提供实验依据。

1 材料

1.1 药物

黄芪、苏木浸膏由中国中医科学院广安门医院制剂中心提供，并由中药煎制机煎制成原液，生药含量为70.7%;准确量取原液，隔水加热蒸发浓缩而制成中药浸膏(含生药 2.1g·ml－1，生产批号20071121)。

1.2 动物

C57BL/6雄性小鼠，6～8周龄，体质量20g±2g，清洁级，由中国医学科学院实验动物研究所提供(许可证号 SCXK-11-00-0006)，中国中医科学院广安门医院动物室喂养。Lewis肺癌荷瘤鼠由中国医学科学院药物研究所提供(许可证号 SYXK(京)2011-0001)。

1.3 试剂

FITC anti-mouseCD4、PE anti-mouse CD25、PEcy5 anti-mouse Foxp3、PE anti-mouse IL-17、CD4+CD25+Regulatory T cell Isolation Kit、LD、MSColumns(Miltenyi Biotic)、RevertiAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)，SYBR Green I Master Mix(Applied Biosystems)，引物由北京赛百盛生物技术公司合成。

1.4 仪器

FACS Calibur Flow Cytometer System(BD)，SM800解剖显微镜(Nikon)，VarioMACS磁性细胞分选仪(Miltenyi)，ABI7500荧光定量 PCR仪(ABI)，DU-640型紫外分光光度计(Beckman)等。

2 方法

2.1 动物模型复制

取传代第12天Lewis肺癌荷瘤小鼠，剥离瘤组织，选取生长良好的肿瘤组织制备肺癌细胞悬液，每只小鼠右腋皮下接种0.2ml(经台盼蓝染色并计数，约含活细胞1×106个/ml)。

2.2 分组及给药

小鼠接种后，随机分为空白对照组、荷瘤对照组、环磷酰胺组、苏木组、苏木+黄芪组，每组20只。空白对照组正常进食进水;荷瘤对照组接种24h后开始给予生理盐水灌胃0.2ml/d;环磷酰胺组接种24h后给予腹腔一次性注射环磷酰胺，剂量60mg/kg;苏木组接种24h后给予苏木浸膏灌胃(1.67g生药/(kg·d))，苏木 +黄芪组接种24h后给予苏木 +黄芪浸膏灌胃(1.67g生药/(kg·d)+黄芪15g生药/(kg·d))。

2.3 观察指标

2.3.1 各组小鼠肺转移情况 接种后14d、21d处死每组小鼠各10只，取肺用生理盐水冲洗，Bouin液固定，解剖显微镜下观察肺转移灶个数。肺转移抑制率(%)=［1－实验组平均肺转移灶个数(个)/对照组平均肺转移灶个数(个)］×100%。

2.3.2 流式细胞仪 检测各组小鼠脾CD4+T淋巴细胞中Th17/Treg细胞百分比动态变化 于接种后14d、21d取每组小鼠各10只，摘眼球放血，断颈处死小鼠，酒精消毒皮肤，迅速取脾称重研磨，200目滤网滤过包膜及脂肪组织等，加入2mLPBS，收集脾细胞悬液计数细胞，取约 1×106细胞重悬于100ulPBS中，按照试剂说明书进行 PECy5-抗 CD4、APC-抗 CD25、PE-抗 IL-17染色，上机检测脾 Th17细胞;FITC-抗 CD4、PE-抗 CD25、PEcy5-抗 Foxp3 染色，上机检测脾Treg细胞。

2.2.3 RT-PCR检测各组小鼠CD4 淋巴细胞 Foxp3、RORγtmRNA动态表达水平 取5×105分选后CD4+、CD25+T淋巴细胞，提取 RNA。引物序列 Foxp3:上游 5'-CTGACCA AGGCTTCATCTGT-3'，下游 5'-AACTCTGGGAATGTGCTGTT-3';RORγt:上游 5'-GGCTCCCTGGATGAATAGAATG-3'，下游 5’-AGGCAGAGGCAGAAAATGTAAAG-3。PCR反应条件:95℃ 5min，95℃ 25sec，55℃ 25sec，72℃ 50sec，72℃ 5min，循环次数为40，设β-actin作为内参照。

2.4 统计学处理

采用SPSS11.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 各组荷瘤小鼠肺转移情况

第14天各组小鼠除荷瘤对照组外未见肺转移灶。表1显示，第21天各组肺转移灶均少于荷瘤对照组，苏木黄芪组、环磷酰胺组与荷瘤对照组差异有统计学意义(P＜0.05);与苏木黄芪组相比，仅环磷酰胺组无显著差异(P＞0.05)。

表1 各组荷瘤小鼠肺转移灶情况(±s)

表1 各组荷瘤小鼠肺转移灶情况(±s)

注:与荷瘤对照组比较:*P＜0.05;与苏木黄芪组比较:△P＜0.05

组别 例数 转移率(%)肺转移灶个数 肺转移抑制率(%)荷 瘤 对 照 组 10 100.00 10.59 ±5.71△ —23.61苏木黄芪组 10 68.55 7.26±2.56* 31.45苏 木 组 10 90.27 9.56±5.21△ 9.73环 磷 酰 胺 组 10 76.39 8.09±5.07＊△

3.2 各组小鼠脾CD4+T淋巴细胞中Th17/Treg细胞百分比及比值动态变化

表2、图1显示，除苏木黄芪组外，各荷瘤组小鼠脾Th17与Treg细胞百分比随时间迁移呈现出上升趋势。第14天和第21天各组间 Thl7细胞和Treg细胞两两比较，与荷瘤对照组相比，其余各组均有显著差异(P＜0.05);与苏木黄芪组相比，仅环磷酰胺组无显著差异(P＞0.05)。各组Th17/Treg比值亦随时间迁移呈现出上升趋势，除苏木黄芪组与正常组比较均存在Th17/Treg比值的平衡失调。

表2 各组荷瘤小鼠脾Thl7细胞与Treg细胞百分比及比值动态变化(±s)

表2 各组荷瘤小鼠脾Thl7细胞与Treg细胞百分比及比值动态变化(±s)

注:与正常组比较:※P＜0.05;与荷瘤对照组比较:*P＜0.05;与苏木黄芪组比较:△P＜0.05

天数(d)组 别 例数 Thl7细胞 Treg细胞Th17/Treg 14d正 常 组10 0.59±0.051 5.17±0.10 0.114荷瘤对照组 10 0.99±0.13△ 9.44±0.91△ 0.105※苏木黄芪组 10 0.78±0.10* 7.00±0.14* 0.111苏 木 组 10 0.86±0.09△＊ 8.12±0.34＊△ 0.105※环磷酰胺组 100.79±0.07* 7.12±0.66* 0.111 21d 正 常 组 10 0.60±0.09 5.19±0.81 0.116荷瘤对照组 10 1.20±0.39△ 9.52±1.01△ 0.126※苏木黄芪组 10 0.79±0.06* 6.42±0.34* 0.123苏 木 组 10 1.10±0.06＊△ 8.20±0.79＊△ 0.134※环磷酰胺组 10 0.78±0.13* 6.05±0.18* 0.129※＊

3.3 各组小鼠CD4+T淋巴细胞 Foxp3、RORγtmRNA动态表达水平变化

表3、图2、图3显示，各组小鼠脾 CD4+T淋巴细胞Foxp3、RORγtmRNA动态表达水平变化，除苏木黄芪组外，各荷瘤组小鼠脾Th17与Treg细胞百分比随时间迁移呈现出上升趋势。第14天和第21天各组间Thl7细胞和Treg细胞两两比较，与荷瘤对照组相比，其余各组均有显著差异(P＜0.05);与苏木黄芪组相比，仅环磷酰胺组无显著差异(P＞0.05)。

图1 荷瘤小鼠脾Thl7/Treg细胞百分比

图2 14d T淋巴细胞 Foxp3、RORγtmRNA的表达

图3 21d T淋巴细胞 Foxp3、RORγtmRNA的表达

表3 各组小鼠CD4+T淋巴细胞Foxp3、RORγtmRNA动态表达水平(±s)

表3 各组小鼠CD4+T淋巴细胞Foxp3、RORγtmRNA动态表达水平(±s)

注:与荷瘤对照组比较:*P＜0.05;与苏木黄芪组比较:△P＜0.05

天数(d)组 别 例数 Foxp3mRNA RORγtmRNA 14d正 常 组10 1.08±0.05 1.18±0.02荷瘤对照组 10 1.16±0.07△ 1.69±0.04△苏木黄芪组 10 1.07±0.02* 1.41±0.06*苏 木 组 10 1.11±0.04＊△ 1.52±0.08＊△环磷酰胺组 10 1.08±0.03* 1.40±0.01*21d 正 常 组 10 1.10±0.10 1.19±0.06荷瘤对照组 10 1.81±0.08△ 1.91±0.14△苏木黄芪组 10 1.53±0.05* 1.28±0.07*苏 木 组 10 1.86±0.02△ 1.69±0.08＊△环磷酰胺组 10 1.62±0.03* 1.19±0.80*

4 讨论

介导免疫耐受的Treg细胞与介导炎症反应的Th17细胞都来源于初始T细胞，两者的功能和分化过程相互对抗，在正常情况下两者保持平衡，有利于机体的免疫稳定状态的维持［3，4］。但在肿瘤发展的早期，Th17细胞发挥促炎性作用，从而抑制肿瘤的生长，但随肿瘤的发展炎症得不到缓解，异常分泌细胞因子就会发挥促肿瘤作用;而Treg细胞在正常情况下，发挥着维持机体内环境稳定的重要作用，但随着肿瘤的进展，表达水平会不断提高，进一步造成免疫耐受，抑制机体对肿瘤的免疫功能;同时，Th17与Treg细胞之间受异常分泌的细胞因子的影响会发生相互转化。因此，Treg/Th17之间的动态失衡最终导致肿瘤发展中免疫编辑的差异，产生免疫逃逸和肿瘤转移［5，6］。

前期研究中［7］，我们已经观察了活血药的代表药物苏木和益气药的代表药物黄芪对肿瘤转移的影响。结果显示，益气药配伍活血药具有抑制某些单纯活血药促进肿瘤转移的趋势;对其作用机制研究显示，益气活血药与单纯活血药比较可以降低Treg细胞表达，抑制Treg细胞相关的转录因子和细胞因子。结合近年来的国内外研究［4］我们认为，Treg细胞及分泌的细胞因子与Th17细胞的表达与功能密切相关，因此Th17细胞可能是益气活血药与活血药干预肿瘤转移作用差异机制中Treg之后的关键环节，调控 Treg/Th17之间的平衡是逆转肿瘤转移过程中炎性内环境免疫逃逸的新策略。

本次实验从各组荷瘤小鼠肺转移灶情况看出，益气活血药(苏木+黄芪)优于单纯活血药(苏木);除苏木黄芪组外，各荷瘤组小鼠脾Th17与Treg细胞随时间迁移呈现出上升趋势，且苏木黄芪组较其余各组有显著差异;Th17/Treg比值亦随时间迁移呈现出上升趋势，除苏木黄芪组外与正常组比较均存在比值的平衡失调。另外，关键转录分子 RORγt及Foxp3呈现出与Th17和Treg细胞相应的动态改变，说明益气活血药在抑制肿瘤免疫耐受的形成和抑制肿瘤发展过程中的免疫炎症反应优于苏木组;益气活血药虽在个别指标上与环磷酰胺组无显著差异，但总体分析仍优于环磷酰胺组。综上，各组药物对肿瘤转移均有一定的抑制作用，但益气活血药优于单纯活血药和化疗药物。

［1］刘鲁明，陈震，陈培丰.对活血化瘀中药治疗恶性肿瘤的思考［J］.中医杂志，2007，48(9):776-779.

［2］于明薇，孙桂芝，李道睿，等.苏木、苏木 +黄芪对 Lewis肺癌荷瘤鼠脾树突细胞的干预作用［J］.中华中医药学刊，2009，27(11):2284-2287.

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［5］Infante Duarte C，Horton HF，Byrne MC，et al.Microbial lipopep tides induce the production of IL-17 in Th cell［J］.J Immunol，2000，165(11):6107-6110.

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［7］于明薇，孙桂芝，李道睿，等.苏木、苏木 +黄芪对 Lewis肺癌荷瘤鼠脾树突细胞的干预作用［J］.中华中医药学刊，2009，27(11):2284-2287.