魏 民，杨京京，王建琴，王 霞，王香婷△，许庆友

(1.河北医科大学中医学院，石家庄 050091;2.河北医科大学中西医结合学院，石家庄 050091;3.河北省蔚县卫生局，河北 蔚县 075700)

肾小管间质纤维化(tubular interstitial fibrosis，TIF)是各种慢性肾脏疾病持续进展的共同病理过程，炎症反应是TIF的始动环节之一，并贯穿其始终，有效抑制炎症反应对控制肾小管间质纤维化的发生发展有着重要意义。本研究采用单侧输尿管结扎的方法制备肾小管间质纤维化模型，通过观察解毒活血法对大鼠肾脏组织白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α (tumour necrosis factor-α，TNF-α)的影响，探讨其对 UUO 大鼠的保护作用及可能机制，为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

50只雌性清洁级SD大鼠，8周龄，体质量200g±10g，河北医科大学动物实验中心提供，随机分为假手术组、模型组、缬沙坦组、解毒活血低剂量组、解毒活血高剂量组5组，每组10只。

1.2 药物及试剂

解毒活血方药(黄芩 15g，金银花 15g，丹参15g，地龙12g，僵蚕10g，大黄6g)由河北医科大学中医学院门诊部药房提供。缬沙坦:由北京诺华制药有限公司生产。TNF-α免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。碘［125I］白细胞介素-1β放射免疫分析药盒购自北京普尔伟业生物科技有限公司。

1.3 造模及药物治疗

实验动物适应性饲养1周后，除假手术组外，其余40只大鼠复制单侧输尿管梗阻模型:10%水合氯醛(3mL/kg)腹腔注射麻醉后，将大鼠仰卧位固定于手术台上，无菌手术操作行腹正中线切口打开腹腔，分离左侧输尿管，用止血钳夹住其中段部位，并在止血钳两侧用4-0号线双重结扎，在两结扎点中间剪断左侧输尿管，分层缝合关闭腹腔。假手术组除不结扎、不剪断左侧输尿管外，其余步骤同前。手术前1d开始所有大鼠灌胃给药，缬沙坦组给予26mg/kg·d，解毒活血低剂量组给予解毒活血中药12g生药/kg·d，解毒活血高剂量组给予 24g生药/kg·d，假手术组和模型组给予等容量生理盐水，共14d。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 病理组织学检查 HE、Masson染色，光学显微镜下观察病理改变。

1.4.2 肾组织IL-1β表达 采用放射免疫平衡法检测。

1.4.3 肾组织TNF-α检测 采用免疫组织化学SABC法。一抗浓度为1∶100，4℃过夜;滴加二抗，滴加 SABC复合物，DAB显色，苏木精复染、脱水、透明、封片。以光镜下细胞间质出现棕黄色颗粒为阳性表达。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 肾组织病理改变

HE染色显示，假手术组未见明显异常;模型组的肾小管间质大量炎症细胞浸润，肾小管上皮细胞变性、坏死、脱落;缬沙坦组和解毒活血高、低剂量组的肾小管上皮细胞变性、坏死及炎症细胞浸润程度均轻于模型组。Masson染色显示，假手术组大鼠间质有少量胶原成分表达;模型组间质可见大量胶原沉积，呈条带状分布。缬沙坦组，解毒活血高、低剂量组的胶原沉积程度均比模型组显著减轻。

2.2 肾组织IL-1β的放免结果

表1显示，与假手术组比较，模型组大鼠肾组织中IL-1β水平明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，各治疗组大鼠肾组织中IL-1β水平下降有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，组间无差异。

Table 1 The expression of IL-1β in renal tissue(±s)

Note:vs Control group:* P＜0.01;vs Model group:▲P＜0.01;vs Model group:■P ＜0.05

Group IL-1β(pg/ml)Control 107.640±14.657 Model 144.510±14.462*Valsartan 130.590± 9.803■Low-dose 127.420±11.274■High-dose 124.580±12.060▲

2.3 肾组织TNF-α免疫组化结果

图1显示，假手术组的肾小管上皮细胞有少量TNF-α的表达，呈浅黄色。与假手术组相比，模型组的表达显著增多，呈棕黄色，各治疗组 TNF-α的表达较模型组均显著减少。

图1 免疫组化检测大鼠肾脏TNF-α的表达

3 讨论

炎症反应是TIF的始动环节之一。各种原因的肾脏损伤，都会导致毛细血管微循环障碍，肾组织缺血、缺氧，继而激活肾脏固有细胞，如系膜细胞、肾小管上皮细胞、间质成纤维细胞等，合成和分泌炎症介质，同时释放大量化学趋化因子，招募循环中的炎症细胞，如单核/巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等，浸润至受损肾间质，引起炎症反应。激活的炎症细胞会释放更多的炎症介质和促纤维化因子。炎症介质不仅使炎症反应级联放大与迁延持续，还对组织细胞造成损伤，导致间质中的成纤维细胞分泌大量胶原成分进行组织修复，使胶原生成增加而降解减少，持续大量的胶原成分在肾间质沉积，最终导致肾小管间质纤维化［1］。因此有效抑制炎症反应对控制肾小管间质纤维化的发生发展有着重要意义。

IL-1β主要由巨噬细胞产生，是一种重要的早期炎症因子，并与TNF-a具有协同作用。研究表明，肾间质中 IL-1β的表达水平与肾小管间质损伤和肾功能减退的严重程度密切相关［2］。IL-1β可促进炎症细胞的黏附与聚集，诱发炎症反应［3］，还可刺激肾小管上皮细胞合成和分泌TGF-β1［4］，在肾纤维化过程中起重要作用。

TNF-α是炎症介质链锁反应中最早的启动因子，通过刺激肾小管上皮细胞和肾小球血管内皮细胞，使MCP-1、细胞间黏附分子-l和血管细胞黏附分子-l的表达上调，不仅使炎症反应进一步加强，产生“级联放大”作用，还会加重对肾小管上皮细胞、血管及其周围组织的损伤［5，6］。TNF-α 又能刺激成纤维细胞的增殖［7］，介导 TEMT［8］，加速肾纤维化进程。

肾小管间质纤维化属中医“腰痛”、“水肿”、“癃闭”等范畴，机制涉及氧化损伤、炎性损伤、细胞凋亡失衡、肾小管上皮细胞表型转化-肌成纤维细胞转分化等。基于中药多成分、多靶点、多途径的作用特点，我们采用解毒活血之法，为临床治疗提供新思路。方药由黄芩、金银花、丹参、地龙、僵蚕、大黄组成，全方具有解毒活血功效，可对抗慢性肾病肾络瘀阻、瘀毒互结的状态［9］。

本实验结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠肾组织中IL-1β、TNF-α的表达明显升高，表明炎症反应是肾小管间质纤维化形成的重要机制之一;经高、低剂量解毒活血方药治疗后，IL-1β、TNF-α的表达水平显著降低，提示解毒活血方药能有效抑制IL-1β、TNF-α的高表达，通过抑制炎症反应来延缓肾小管间质纤维化的进程。

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