王金香 邓爱军

潍坊医学院附属医院，山东潍坊 261041

川芎嗪对缺氧时视网膜血管内皮细胞HIF-1α、VEGF表达及细胞增殖的影响

王金香 邓爱军▲

潍坊医学院附属医院，山东潍坊 261041

目的研究川芎嗪对缺氧时体外培养的牛眼视网膜血管内皮细胞（BREC）VEGF表达及细胞增殖活性的影响，探讨川芎嗪治疗视网膜新生血管性疾病的药理机制及可行性。 方法CoCl2模拟缺氧处理培养的BREC细胞，用浓度分别为20、40、120 μg/mL的川芎嗪分别加入细胞培养液中24 h，采用ELISA法检测细胞培养上清液VEGF含量，免疫组织化学法和生物荧光法分别检测细胞PCNA的表达、细胞内ATP含量以分析细胞增殖能力，采用免疫组织化学法检测HIF-1α的表达。 结果 川芎嗪可减少缺氧引起的视网膜血管内皮细胞中PCNA的表达，降低细胞内ATP含量，降低培养上清液中的VEGF浓度，且呈剂量依赖性。结论 川芎嗪可抑制缺氧引起的视网膜血管内皮细胞的增殖。其机制可能是通过抑制HIF-1α途径来实现的。

川芎嗪；视网膜新生血管；血管内皮生长因子；缺氧诱导因子

笔者在缺氧时的牛眼视网膜血管内皮细胞（BREC）培养上清液中加入不同浓度的川芎嗪，研究其对HIF-1α表达的影响，及对体外培养的血管内皮细胞增殖的作用，探讨川芎嗪的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

盐酸川芎嗪注射液，由无锡市第七制药有限公司生产，规格为40 mg/2 mL，批号010913。药物用培养基稀释至所需浓度。F12培养基（Gibco，美国）；兔抗HIF-1α多克隆抗体（武汉博士德）；胎牛血清（Gibco，美国）；EBM-2 Basal Meidum（北京毕特博）。免疫组化采用北京中山公司免疫组化试剂盒（二步法）。其他试剂皆为分析纯。

1.2 BREC细胞的培养

取死后3 h内健康牛眼 （取自潍坊肉联厂），70%酒精浸泡，角膜缘后4 mm剪开，剥出视网膜神经层，剪碎、匀浆，孔径80 μm金属筛网过滤， 洗脱液离心 （1 000 r/min，7 min），0.02%胶原酶Ⅰ消化（37℃，1～2 h），离心洗涤并收集细胞，接种于鼠尾胶原培养皿内，20%胎牛血清的M199和EBM-2混合培养液，放入37℃5%CO2培养箱培养。培养液次日更换继续培养。以后每3天换液1次。长至近融合状态时，用0.1%胰蛋白酶消化、传代细胞。血管内皮细胞鉴定采用第Ⅷ因子相关抗原检测法，纯度为90%以上[1]。

1.3 细胞处理及分组

将对数生长期的BREC细胞分别以浓度1.5×105/mL细胞悬液接种于24孔培养板，置于37℃5%CO2培养箱内培养24 h，细胞分为以下3组：F12培养基常规培养组 （正常对照），模拟缺氧组（加入终浓度125 μmmol/L的CoCl2）和药物治疗组（加入含不同浓度川芎嗪 20、40、120 μg/mL），各组分别培养24 h，每项指标每组各测6个培养孔，分别取平均值。

1.4 培养上清液VEGF含量ELISA法测定

按照说明书步骤严格进行操作，在酶标仪波长492 nm比色定量。所有标本均作双管检查，对VEGF含量在标准曲线最高值以外的标本稀释10～100倍后重新测定。

1.5 PCNA免疫组化

-10℃甲醇固定培养细胞5 min，用3%H2O2孵育5 min后冲洗，加入1∶100稀释的一抗于4℃过夜，洗后滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育 20 min，PBS洗后以DAB显色。阴性对照以PBS液代替一抗。结果以胞核内有棕黄色颗粒为阳性判定标准，高倍镜下（×400）随机选择每张切片5个视野，采用计算机图像分析系统进行灰度分析。

1.6 细胞内ATP含量测定

培养孔中加入煮沸的PBS 3 mL，振荡后立即吸入试管中，沸水浴10 min后冰水冷却，低温离心13 000 r/min 15 min，将上清液试管置于冰水中待测。反应杯中加入样品0.2 mL，放入荧光光度计反应暗室，微量进样器向反应杯中注入荧光素-荧光素酶液0.8 mL，测定相对发光强度。按绘制好的ATP标准曲线计算出ATP含量。

1.7 HIF-1α免疫荧光染色

-10℃甲醇固定培养细胞5 min，冲洗后，0.3%H2O2吐温30 min，PBS 洗 3 次，1∶100 稀释的 RABBIT Anti-HIF-1α 细胞于4℃过夜，洗后滴加FITC标记山羊抗兔IgG抗体，37℃孵育60 min，PBS冲洗细胞后于荧光显微镜下观察。阴性对照以PBS液代替一抗。结果判定以细胞核或胞浆呈绿色荧光为阳性标准，每张切片随机选择5个视野在高倍镜下（×400）采用计算机图像分析系统进行荧光分析。

1.8 数据处理

应用SPSS 10.0统计分析软件包进行。数据均以均数±标准差（±s）表示，组间比较用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血管内皮细胞培养上清液VEGF的检测

表1显示，缺氧时BREC细胞培养上清液中VEGF浓度增加，而不同浓度的川芎嗪可减少缺氧引起的VEGF增加，且呈剂量依赖性。当川芎嗪浓度为20 μg/mL时，其培养上清液VEGF水平已显著下降（P<0.05）。见表1。

2.2 血管内皮细胞PCNA、HIF-1α的表达及ATP含量

表1显示，缺氧时BREC细胞中PCNA、HIF-1α表达及ATP含量均增加，而不同浓度的川芎嗪可减少缺氧引起的PCNA、HIF-1α表达增加及ATP浓度升高，且呈剂量依赖性。当川芎嗪浓度为20 μg/mL时，其PCNA、HIF-1α表达及ATP含量水平已显著下降（P<0.05）。见表1。

表1 川芎嗪对缺氧时BREC细胞HIF-1α、VEGF分泌及细胞增殖的影响（±s，n=6）

表1 川芎嗪对缺氧时BREC细胞HIF-1α、VEGF分泌及细胞增殖的影响（±s，n=6）

组别 川芎嗪剂量（μg/mL） VEGF（ng/L） PCNA ATP（ng/L） HIF-1α正常对照组缺氧组缺氧+药物组--2 0 40 120 76.66±8.42 201.47±11.38 186.52±10.33 156.89±9.55 118.63±8.36 31.36±2.36 61.57±5.52 56.69±1.66 50.44±3.14 40.98±2.58 8.65±0.43 40.52±2.85 32.63±3.10 26.65±1.89 18.66±2.35 8.56±0.53 50.41±2.97 41.37±2.11 29.59±3.24 17.78±1.33

3 讨论

川芎嗪化学名为四甲基吡嗪，近年以川芎总生物碱中分离出1号结晶为甲荃吡嗪，3号结晶为佩洛里因[2]。1号结晶药理研究证明是一种新型钙离子拮抗剂，有活血化瘀，抗血小板凝集，兴奋延髓呼吸中枢及血管运动中枢，扩张血管及支气管平滑肌，改善微循环等作用[3]。因其治疗心脑血管疾病疗效好、副作用少而广泛用于临床[4-6]。

本研究中，笔者发现缺氧时BREC细胞中PCNA表达增加，细胞内ATP含量增加，而不同浓度的川芎嗪可减少缺氧引起的PCNA表达，降低细胞内ATP含量，且呈剂量依赖性。当川芎嗪浓度为20 μg/mL时，其PCNA表达、细胞内ATP含量已显著下降（P<0.05）。表明川芎嗪可抑制缺氧引起的血管内皮细胞的增生。这与以往报道相符[5-8]。本实验中同时发现缺氧时BREC细胞培养上清液VEGF增加，而不同浓度的川芎嗪可减少缺氧引起的VEGF增加，且呈剂量依赖性。当川芎嗪浓度为20 μg/mL时，其培养上清液中VEGF水平已显著下降（P<0.05）。表明川芎嗪可抑制缺氧引起的血管内皮细胞VEGF分泌的增加。

本研究中，笔者还发现缺氧时诱导BREC细胞中HIF-1α表达增加，而不同浓度的川芎嗪可减少缺氧引起的HIF-1α表达，且呈剂量依赖性。当川芎嗪浓度为20 μg/mL时，其细胞中HIF-1α水平已显著下降（P<0.05）。这可能提示川芎嗪还可以通过抑制HIF-1α途径来抑制VEGF的表达，从而抑制血管内皮细胞的增殖活性，这在以往文献[7-12]中未见报道。

综上所述，川芎嗪可减少缺氧时的视网膜血管内皮细胞VEGF的分泌，从而抑制缺氧引起的视网膜血管内皮细胞的增殖。其机制可能是通过抑制HIF-1α途径来实现的。

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The influence of ligustrazine on HIF-1α,VEGF expression and cell proliferation in hypoxic retinal microvessels endothelial cells

WANG Jinxiang DENG Aijun▲
Weifang Medical College Affiliated Hospital,Weifang 261041,China

ObjectiveTo study the influence of ligustrazine on HIF-1α,VEGF expression and cell proliferation in hypoxic retinal microvessels endothelial cells,in order to explore the mechanisms and feasibility of ligustrazine in treatment of pharmacological.MethodsCoCl2 was used to simulate hypoxia training BREC cells,ligustrazine with a concentration of 20,40,120 μg/mL were added to the cell culture fluid 24 h，VEGF levels in cell culture supernatants were measured by ELISA.Immunohistochemical method were used to detect the expression of PCNA and bioluminescence,intracellular ATP content in order to analyze cell proliferation,immunohistochemical method was used to detect the expression of HIF-1α.ResultsTMP could reduce the expression of PCNA in hypoxia-induced retinal vascular endothelial cells,reduced the intracellular ATP content,reduced the concentration of VEGF in the culture supernatant,and it showed a dose-dependent manner.ConclusionLigustrazine can inhibit cell proliferation of hypoxic retinal microvessels endothelial cells.This effect might be related to its function of decreasing HIF-1α expression.

Ligustrazine;Retinal neovascularization;Vascular endothelial growth factor(VEGF);HIF-1α

R-33

A

1674-4721（2012）11（b）-0005-02

山东省博士基金资助项目（编号：2006BS03050）。

▲通讯作者

2012-09-24 本文编辑：林利利）