湖北医药学院人体解剖教研室（十堰442000）

冯 娜 彭兴春 贺细菊 戴冀斌△▲ 张 涛△

材料与方法

1 实验材料 与试剂DMEM／F12培养基（武汉博士德）；特优级胎牛血清 FBS（Sig ma）；B27（Gibco）；bFGF（Peprotech）；胰酶、左旋多聚赖氨酸（Sigma）。抗体：鼠抗人anti-nestin（1∶100）（Sigma），anti-神经元特异性烯醇酶NSE（Sigma），anti-GFAP的单克隆一抗及相应的荧光标记二抗（Sigma）；兔抗鼠HIF-1α（1∶100）（武汉博士德），羊抗兔FITC荧光标记二抗（武汉博士德）；DNA分子Marker（Fer mentas）；TRIzol试剂（Promega）；c DNA试剂盒（MBI）；T aq酶（Biostar）。

2 实验方法

2.1 神经干细胞的体外培养、增殖与分化 实验动物：E12～14 d昆明小鼠（SPF级），武汉大学医学院实验动物中心提供。参照徐进等［8］的方法体外培养E12～14 d胚鼠大脑皮质部分NSCs。将培养5～7 d的神经球以每平方厘米20～30个细胞球接种于置有预先经PLL包被盖玻片的24孔培养板中，加入含10%FBS的DMEM／F12（不加任何生长因子）诱导分化。每2～3 d换液1次，观察比较并记录。

2.2 实验分组及低氧模型的建立 对照组：常氧（20%O2）组；实验组：低氧10%O2组。每组又分为低氧1 d、低氧3 d和低氧5 d组，细胞低氧时间从原代培养第1天开始计算。低氧模型为一有进、出气孔的密闭容器，通入含5%CO2，3%O2和92%N2平衡的混合气体，维持饱和湿度，置于37℃常规培养箱中。

2.3 荧光免疫细胞术鉴定 对神经球进行鼠抗Nestin、鼠抗HIF-1α免疫细胞化学染色，对分化12～14d细胞进行鼠抗NSE，鼠抗GFAP免疫细胞化学染色。

2.4 RT-PCR检测HIF-1αmRNA的表达 采用TRIzol法提取总RNA，使用Pri mer 5.0软件分析设计引物，得到小鼠HIF-1α及参照β-actin的引物序列：HIF-1α的上游引物序列为5-TCCAAGCCCTCCAAGTATGA-3’，下游引物序列为5’-TGCCTTAGCAGTGGTCGTTT-3’，扩增产物长度这202bp。βactin上游引物序列为5’-ATAAACCTGGCAATTGTC-3’，下游引物序列为5’-CCTGAGTTGAAAATGGAT-3’，扩增产物长度为280bp。RT-PCR条件：按照逆转录试剂盒说明操作，反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性50 s，54℃退火60 s，72℃延伸60s，共35个循环；72℃总延伸10 min；……