杨玉兰，姜文侠，刘琦，孙瑞雪

1(天津市工业生物系统与过程工程重点实验室，中国科学院系统微生物工程重点实验室，中国科学院天津工业生物技术研究所，天津，300308)2(天津科技大学，天津，300457)

氨肽酶(aminopeptidase)是蛋白水解酶中外肽酶的一类，它们能从蛋白质和多肽链的N末端顺序水解氨基酸，其催化机理可以用下式表示:

甲硫氨酸氨肽酶是氨肽酶中的一种，在蛋白质加工过程中负责切除新生肽链N端的起始甲硫氨酸，对细胞的成熟，生长和防御都具有重要的作用，维持着细胞的动态平衡［1］，此外还作为转录调控因子、特异性位点的重组因子和毒素受体参与抗生素的活化与转运［2］。甲硫氨酸氨肽酶特有的水解方式和功能，决定了其广泛应用于食品、医药、发酵、饲料及生物技术等行业［3－6］。目前氨肽酶制剂主要应用于功能肽的制备和蛋白质水解食品的生产加工过程，用以提高营养质量，改善产品的最终风味。由于氨肽酶能促进不良口感疏水肽的水解、释放其他具有愉快口感的肽和自由氨基酸［7］，氨肽酶已经成为水解蛋白脱苦制剂的首选。

菌种是工业发酵生产氨肽酶的物质基础，从自然界筛选并在实验室诱变进化一直是发现和创新工业微生物菌种的重要手段。常规的菌种选育方法工作量大、周期长、效率低、成本高［8］。采用高通量方法筛选新型的氨肽酶和氨肽酶高产菌株，既可提高工作效率，降低成本，又能大幅度地提高筛选速度［9－10］。但高通量筛选氨肽酶产生菌关键程序中酶活测定的工作量非常大，消耗的试剂也很多，特别是用于酶活测定的底物价格昂贵。为了使测定方法更加方便迅速，降低消耗，以适应微量化发酵培养的酶活测定，实现真正意义上的高通量筛选，本文在对硝基苯胺法的基础上，对3种不同来源的甲硫氨酸氨肽酶进行检测条件的优化，建立适应高通量筛选的微量化检测方法——酶标板法，并与常规的对硝基苯胺法进行比较以验证该方法的可行性。

1 材料与方法

1.1 菌种和培养基

甲硫氨酸氨肽酶产生菌11-11-16-2-5AL、11-10-18-7-AL和12-3-16-14AL，为本实验室分别从麦酱、臭豆腐和腐乳中分离。

种子培养基(g/L):麦芽糊精8，酵母粉2，蛋白胨8，KH2PO41，MgSO40.2，pH 7.2，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基(g/L):麦芽糊精15，酵母粉10，蛋白胨5，牛肉膏2，KH2PO42.7，MgSO40.1，NaCl 1，pH 7.2，121 ℃灭菌20 min。

1.2 主要试剂和仪器

甲硫氨酸对硝基苯胺(sigma公司，分析纯)，对硝基苯胺(sigma公司，分析纯)，其它均为市售分析纯。

全功能微孔板检测仪(Bio-Tek)，紫外分光光度计(普析通用 TU-1810PC型)，酶标板(Greinerbio-one)，8道自动移液器(BRAND)，卧式恒温振荡器(精骐 IS-RDH1型)，电热恒温水浴锅(泰斯特);高速冷冻离心机(Hettich)，48孔深孔板(上海甘薇)。

1.3 溶液

氨－氯化铵缓冲液(40 mmol/L):称取1.07 g NH4Cl溶于90 mL蒸馏水中，以5%的氨水调pH至8.0，定容至100 mL。

底物溶液(6 mmol/L):称取0.016 g甲硫氨酸对硝基苯胺，于10 mL蒸馏水中50℃水浴至完全溶解，定容至10 mL。

终止液:50%的乙酸水溶液。

对硝基苯胺溶液:准确称取对硝基苯胺，以蒸馏水配制400 μmol/L溶液，然后将其依次稀释至150、200、250、300 μmol/L 和 350 μmol/L。

1.4 粗酶液的制备

分别挑取甲硫氨酸氨肽酶产生菌11-11-16-2-5AL、11-10-18-7-AL和12-3-16-14AL的单菌落接入种子培养基中，于36℃摇床200 r/min培养6～8 h，制备种子液。将种子液按5%接种量，接种至发酵培养基，于36℃摇床200 r/min培养24 h，为甲硫氨酸氨肽酶的发酵液。将发酵液于4℃、10 000×g离心得上清液，即为甲硫氨酸氨肽酶的粗酶液。

1.5 酶活的测定

酶活测定的原理:氨基酸对硝基苯胺溶液无色，在氨肽酶的作用下水解生成黄色的对硝基苯胺和游离的氨基酸。对硝基苯胺在紫外范围有吸收，以紫外分光光度法测定其吸光度，计算氨肽酶的酶活。

酶活的定义:于60℃，pH 8.0，每分钟水解氨基酸对硝基苯胺产生1 μmol对硝基苯胺所需的酶量，定义为一个酶活单位(U)。

常规对硝基苯胺法［11－12］:向比色管中加入2 mL NH3-NH4Cl缓冲液和1 mL底物溶液，再加入l mL稀释一定倍数的粗酶液，60℃水浴反应10 min，反应结束立即加入终止液6 mL，终止反应。空白对照以蒸馏水代替粗酶液。以紫外分光光度计于380 nm测定吸光度，根据标准曲线计算酶活。

酶标板法:在酶标板的微孔中加入40 μL NH3-NH4Cl缓冲液和20 μL底物溶液，然后加入20 μL经适当稀释的粗酶液，加盖子后置于60℃水浴反应10 min，反应结束立即加入终止液120 μL，终止反应。空白对照以蒸馏水代替粗酶液。以酶标仪于380 nm测定吸光度，根据标准曲线计算酶活。

2 结果与分析

2.1 酶反应条件的优化

2.1.1 pH对酶反应的影响

反应液的pH值对酶活测定的影响很大，酶在一定条件下都有其最适pH。最适pH的测定在以下50 mmol/L的缓冲液中进行:乙酸钠(pH 4.0～5.5)、Na3PO4(pH 6.0～7.0)、Tris－HCl(pH 7.5～8.5)和HBO3-NaCl(pH 9.0～11.0)，其它测定条件不变［13］。酶活测定结果如图1所示。

图1 pH对酶活的影响

从图1可见3株菌的甲硫氨酸氨肽酶均在pH 8.0左右时活力最高，而当pH低于5.5或高于10.5时未检测到酶活，表明它们是弱碱性氨肽酶，在强酸和强碱环境中失活。

2.1.2 缓冲液浓度的选择

考察pH 8.0的浓度为10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L 和 100 mmol/L 的Tris-HCl缓冲液对氨肽酶活性的影响，结果如图2所示。

图2 缓冲液浓度对酶活的影响

从图2可知3种氨肽酶在缓冲液浓度为20～80 mmol/L的范围内活力较强，其中Tris-HCl浓度为40 mmol/L时酶活力最强。

2.1.3 底物溶液浓度的选择

考察底物浓度在2～10 mmol/L范围对酶活反应的影响，结果见图3。

图3 底物浓度对酶活的影响

底物甲硫氨酸对硝基苯胺的浓度影响酶促反应速度，从图3可以看出，随着底物浓度的增加三种氨肽酶的酶活也相应升高，底物浓度达到6～7 mmol/L时酶活最高，但当底物浓度超过7 mmol/L时，酶活反而降低。考虑到底物成本，故可选择底物浓度为6 mmol/L。

2.1.4 反应温度对酶活的影响

测定在10～100℃范围内，温度对酶活的影响，结果见图4。

图4 温度对酶活的影响

随着温度的增加3种酶的活力也均相应升高，当温度为60℃时酶活力最高。

2.1.5 反应时间对酶活测定的影响

在5～20 min的酶反应时间范围内，测定酶的最佳反应时间，结果见表1。从表1可以看出，酶解时间在10 min时酶活最高。

表1 酶解时间对酶活测定的影响

2.1.6 缓冲液的离子对酶活测定的影响

反应体系中缓冲液的离子影响酶蛋白的空间结构，从而影响其催化能力，所以，测定酶活时应尽可能统一反应缓冲液的种类和离子强度。考察KH2PO4、Tris-HCl、H3BO3-NaOH、NH3-NH4Cl、2-氨 基-2-羟 甲基-(1，3)丙二醇-HCl缓冲液对3种氨肽酶活的影响，缓冲液的浓度均为40 mmol/L，pH均为8.0，其它测定条件不变，结果如表2。在NH3-NH4Cl的缓冲液中酶活最高。

表2 缓冲液离子对酶活的影响

从上述结果可看出三种不同来源的甲硫氨酸氨肽酶酶活检测的最适条件相同，确定甲硫氨酸氨肽酶活性测定的酶反应条件为:40 mmol/LNH3-NH4Cl缓冲液，pH 8.0，底物甲硫氨酸对硝基苯胺浓度6 mmol/L，反应温度60℃，反应时间10 min。

2.2 酶标板法与常规对硝基苯胺法的对比

2.2.1 酶标板法和常规对硝基苯胺法的光吸收曲线比较

酶标板法和常规对硝基苯胺法的光吸收曲线见图5和图6。2种方法的最大吸收峰均在380 nm左右，酶标板法与常规对硝基苯胺法的光密度一致。

图5 酶标板法对硝基苯胺的光吸收曲线

2.2.2 酶标板法和常规对硝基苯胺法线性范围的比较

配制系列梯度浓度的对硝基苯胺标准溶液，以纯水为对照，在380 nm波长处，分别用酶标板法和常规对硝基苯胺法测定对硝基苯胺的含量。以吸光度为横坐标，以对硝基苯胺浓度为纵坐标，绘制标准曲线，两种方法测定的标准曲线分别如图7、图8。酶标板法对硝基苯胺的标准曲线满足回归相关系数0.999以上的回归直线，两个端点所对应的对硝基苯胺浓度为20.720～55.252 μg/mL，与常规方法一致。

图6 常规法对硝基苯胺的光吸收曲线

图7 酶标板法测定酶活的标准曲线

图8 常规法测定酶活的标准曲线

2.2.3 酶标板法和常规对硝基苯胺法酶活测定结果的比较

对三种不同来源的氨肽酶粗酶液样品，分别用酶标板法和常规对硝基苯胺法进行酶活测定，每种粗酶液平行测定3次，取平均值。测定结果及2种检测方法的相对标准偏差见表3，由表3的结果可看出，酶标板法和常规法检测氨肽酶酶活的结果基本一致。

表3 酶标板法和常规法酶活测定的结果对比

3 讨论

目前，氨肽酶的酶活测定方法有对硝基苯胺(pNA)法及荧光底物法［14］。荧光底物法以氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)为底物，反应一定时间，测定水解产物的荧光性，该法迅速灵敏，但荧光底物价格昂贵，成本远远高于对硝基苯胺法。国内外氨肽酶的检测多采用对硝基苯胺法，大多选择405 nm波长处比色测定［12，14］，本文通过对对硝基苯胺进行波谱扫描，确定其在380 nm具有最大吸收值，故采用380 nm的波长进行酶活测定，以提高检测的灵敏度。

采用对硝基苯胺法测定氨肽酶酶活，通过添加氨基酸对硝基苯胺底物，可以筛选水解肽链N端不同氨基酸的氨肽酶及其高产菌。氨肽酶微量化检测方法，与常规的对硝基苯胺法相比，操作简单方便、消耗的试剂少、检测成本低、工作效率高，与微型化发酵培养相结合，可以实现氨肽酶产生菌真正意义上的高通量筛选。

［1］Gonzales T，Baudouy J R.Bacterial aminopeptidases:properties and functions［J］.FEMS Microbiology Reviews，1996，18(4):319－344.

［2］Wang X，Wang B，Zhang Q.Anti-tumor targeted drug delivery systems mediated by aminopeptidase N/CD13［J］.Acta Pharmaceutica Sinica B，2011，1(2):80－83.

［3］魏亚娟，田亚平，须瑛敏.枯草芽孢杆菌脱苦氨肽酶在水解大豆分离蛋白中的应用研究［J］.食品工业科技，2008，29(4):149－151.

［4］Barry C M，Cuinn G O.Debittering of a tryptic digest of bovine β-casein using porcine kidney general aminopeptidase and X-Prolydiptptidyl aminopeptidase from Lactococcus lactis subsp.Cremoris AM2［J］.Journal of Food Science，2000，65(7):1 145－1 150.

［5］Scharf U，Stolz P，Huscroft S C，et al.Use of aminopeptidase in dough，doughs and bread improvers comprising aminopeptidase［P］.China，Patent Application CN101018485A，2005.

［6］Appelros S，Petersson U.Activation Peptide of Carboxypeptidase B and Anionic Trypsinogen as early Predictors of the Severity of Acute pancreatitis［J］.British Journal of Surgery，2001，88(2):216－221.

［7］Toldrá F，Aristoy M，Flores M.Contribution of muscle amino peptidases to flavor development in dry-cured ham［J］.Food Research International，2000，33(3/4):181－185.

［8］韩闯，杨盛昌.高通量筛选技术及其应用［J］.生物技术通报，2005，2(1):2－25.

［9］Coma I，Clark L，Diez E，et al.Process validation and screen reproducibility in high-throughput screening［J］.Journal of Biomolecular Screening，2009，14(1):66－76.

［10］Macarron R，Banks M N，Bojanic D J，et al.Impact of high-throughput screening in biomedical research［J］.Nature Reviews Drug Discovery，2011，10(3):188－195.

［11］田亚平，须瑛敏.一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的纯化及酶学性质［J］.食品工业科技，2006，32(3):7－9.

［12］吴庆勋.氨肽酶高产菌的选育及发酵条件优化［D］.无锡:江南大学生物工程学院，2010.

［13］刘冰心，曹敏杰，蔡秋凤，等.草鱼肌肉亮氨酸氨肽酶的分离纯化与性质研究［J］.集美大学学报:自然科学版，2008，13(1):24－29.

［14］Umetsu H，Arai M，Ota T，et a1.Purification and properties of an aminopeptidase from the mid-gut gland of scallop(Patinopecten yessoensis)［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology，2003，136(4):935－942.