曾雪峰，夏文水

(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)

我国的淡水鱼产量高居世界首位，但由于淡水鱼的含水量大、土腥味重、不易贮藏的原料特性及淡水鱼制品加工中关键技术的缺失等原因，致使目前淡水鱼的加工量还不足淡水鱼养殖产量的15%，远远落后欧美日等发达国家的水平。应用生物发酵方法来保持和改善肉类制品的品质或抑制腐败菌的生长是一种很好的食品加工保藏方法［1］。湘西传统酸鱼是我国湖南湘西地区一种传统淡水全鱼发酵制品，产品具有酸辣适口、回甜咸鲜、香气独特、回味醇厚、保质期长等特点。是一种高蛋白、低脂肪、生物胺含量低、富含多种游离氨基酸的功能性食品。但湘西传统发酵全鱼制品大多是手工作坊式生产，自然发酵微生物种类的安全性难以保障，生产周期长，质量不稳定，安全性差，工业化程度低。

湘西传统发酵肉制品中栖息着种类繁多、数量丰富的微生物，主要是乳酸菌［2］。麻成金等人对湘西传统酸肉的优势乳酸菌进行了分离筛选，选育出具有产酸快、发酵特性好、符合产业化要求性状的米酒乳杆菌作为发酵剂［2］。而迄今为止，对湘西酸鱼中乳酸菌的菌种特性尚无相关报道。考查这种传统美食中存在的乳酸菌菌株特性，对研究湘西传统酸鱼的风味、质构、色泽及贮藏性具有相当的理论指导意义，对改进我国淡水全鱼发酵制品传统发酵工艺、实现其工业化生产具有重要现实意义。本研究从湘西传统淡水全鱼发酵制品中分离的196株乳酸菌株进行了菌群分布分析、产酸速率、耐盐耐硝酸盐、抑菌性、氨基酸脱羧酶活性等试验，以期得到适合工业化生产发酵鱼制品的优良菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株筛选样品

本课题分别选取湘西凤凰、花垣两种优质传统低盐发酵酸鱼作为菌株分离样品。其中凤凰低盐酸鱼标为XXF;花垣低盐酸鱼标为XXH。

1.1.2 实验材料

蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、琼脂、酵母膏、溴甲酚紫、精氨酸、半胱氨酸等为BR级。

乙酸钠、NaCl、柠檬酸二铵、KH2PO4、MnSO4、Mg-SO4、NaOH、HCl、醋酸铅、Na2SO3、CaCO3等试剂均为AR级。

1.1.3 实验仪器与设备

相差显微镜(XSS-2);洁净工作台(HS-1300);电蒸恒温培养箱(XMT-152A);紫外可见分光光度计(WFZ UV-2100);电子天平(FA 1104);手提式压力蒸汽灭菌锅(YQX-LS-18SI)。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基［3］

MRS培养基、硝酸盐还原试验培养基、精氨酸产氨培养基、葡萄糖产气培养基、产H2S培养基、产H2O2检测用培养基、明胶液化培养基、淀粉水解培养基、产黏液培养基、醋酸盐琼脂培养基。

1.2.2 酸鱼制作方法

依照湘西传统酸鱼制作工艺方法，称取体重100～150 g的新鲜鲤鱼，经去鳞、取鳃、除内脏，清水洗净，并根据当地消费者的喜好，按一定比例添加食盐和各种香辛料，混合均匀后置冰箱中腌制24 h后，晒制2 d，以除去部分水分，然后与适量谷类化合物混匀，并在鱼肚中塞入部分谷类化合物，陶瓷坛的底部铺上部分碳水化合物作为底料，层鱼层辅料，压紧，顶部铺上一层辅料后铺上一层朔料，加盖封严。自然温度发酵成熟。XXF和XXH的具体生产工艺及配方详见表1。不同生产阶段(0，10，20，30，40 d)的酸鱼样品被分别收集置于冰箱中保存备用。

表1 湘西传统发酵酸鱼工艺条件

1.2.3 乳酸菌的分离鉴定

无菌操作，分别准确称量25 g XXF、XXH，绞碎后各自加225 g的无菌生理盐水，振荡摇匀后梯度稀释至适宜浓度，无菌移取0.1 mL稀释样液，均匀涂布到D 9 cm固体MRS培养基中，30℃培养48 h后挑取可疑乳酸菌菌株反复划线培养，获得纯菌株。并对分离纯化菌株的菌落形态、革兰氏染色、葡萄糖产酸试验及过氧化氢酶试验进行初步菌株特性鉴定。其中革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性的菌株被保存在－18℃，含30%甘油的液体MRS培养液中。采用APICHL50系统对分离的菌株鉴定到种。

1.2.4 生理生化实验［3］

经分离的乳酸菌，通过葡萄糖产气试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、运动性试验、产硫化氢试验、醋酸盐试验、产黏性试验、精氨酸产氨试验、温度试验对其菌株特性进行分析。

1.2.5 产酸速率实验［4］

将分离得到的不同乳酸菌株接种到MRS液体培养基中培养，同时以未接种的MRS液体培养基作空白对照，30℃培养0，4，8，12，16，20和24 h后分别测定其pH值。

1.2.6 耐盐性实验、耐亚硝盐实验［4］

将活化后待测乳酸菌株以1%(V/V)接种至含有 4%、6%、10%的 NaCl浓度，50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg的NaNO2浓度液体MRS培养基中，分别在30℃厌氧培养36 h和24 h，同时做空白对照，于λ=600 nm处测定其OD值。

1.2.7 耐酸和胆盐实验［5］

将分离的菌株30℃过夜培养活化，取0.5 mL的细菌培养液接种于10 mL的磷酸盐缓冲液中，用5 mol/L HCl分别调 pH 值至2.5、3.9、9.6，初始菌液浓度调为106～108CFU/mL，置于37℃培养3 h。取2 mL活化菌液分别接种于8 mL含0.1%、0.2%和0.3% 胆盐的MRS培养液中培养4 h后测定活菌数。存活菌数采用平板活菌数计数法，计算其活菌数。菌株的存活率为MRS琼脂平板测得的活菌数与初始菌数的百分比。

1.2.8 抑菌性实验［4］

取经上述试验的分离菌株活化后，在MRS液体培养基中30℃培养48 h，离心取发酵上清液。选用大肠杆菌、李斯特杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，分别取0.1 mL经活化12 h的大肠杆菌、李斯特杆菌和金黄色葡萄球菌菌液涂布于基础培养基上，在指示菌平板上间隔打孔，分别在每个孔内滴加200 μL乳酸菌发酵上清液，30℃培养24 h后测量各待测菌株抑菌圈的大小。

1.2.9 氨基酸脱羧酶实验

将活化后的待测菌株分别按1%(V/V)接入添加有1%(m/V)组氨酸、酪氨酸、赖氨酸及鸟氨酸的含0.06%溴甲酚紫作为指示剂的MRS培养液中，30℃厌氧培养7天后观察培养液颜色变化，颜色由黄变紫表示菌株氨基酸脱羧酶活性阳性。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离鉴定

从湘西传统发酵酸鱼中共分离出201株菌株，其中革兰氏阳性菌、葡萄糖产酸和过氧化氢酶阴性菌株196株。XXF中分离出96株，XXH分离出100株。分离出的菌株菌落光滑整齐、短杆或球状、白色、透明或不透明、菌落呈圆形、表面湿润光滑、边缘整齐、形态微小、菌落直径在1.0～2.0 mm之间，201株疑似乳酸菌株中有98株革兰氏阳性球菌、98株革兰氏阳性杆菌、1株革兰氏阴性球菌、4株革兰氏阴性杆菌、杆菌呈短杆状，两端平直或稍弯曲，无芽孢，无鞭毛，球菌多呈单个分布。

API鉴定结果表明湘西传统酸鱼中分离的196株乳酸菌种类及含量分别是:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(32.1%)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)(28.1%)是主要的乳酸菌菌株，接着是明串珠菌(Leuconostoc)(21.9%)、食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)(14.3%)，以及零星的肠球菌(Enterococcus durans)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。由表2可知，戊糖片球菌和植物乳杆菌是发酵过程中的第一优势菌，而明串珠菌在发酵的初始阶段占据优势，在发酵后期已不再有明串珠菌检出，食品乳杆菌在发酵中后期保持稳定。明串珠菌在发酵起始阶段好氧发酵产酸，抑制了好氧菌、不耐酸及其它微生物的生长，随着发酵时间的延长和pH值的降低，耐酸的植物乳杆菌和戊糖片球菌成为了酸鱼的主要优势菌群，从而授予产品独特的风味和较长的保存期。

表2 湘西传统发酵酸鱼发酵期间乳酸菌群的消长变化

2.2 乳酸菌的生理生化实验

将分离出的乳酸菌株进行菌种特性试验，结果见表3:试验结果表明所有的菌株均未产气、不具有硝酸盐还原性、无运动性、不产硫化氢;所有菌株均能在15℃条件下生长，部分菌株在4℃下能生长以及少部分菌株在45℃时能生长;1株(1.6%)植物乳杆菌和1株(1.8%)戊糖片球菌在蔗糖培养基上具有产黏特性;2株(3.2%)植物乳杆菌、3株(5.5%)戊糖片球菌、1株(3.6%)食品乳杆菌和1株(33.3%)肠球菌水解精氨酸产氨。

表3 湘西传统发酵酸鱼乳酸菌生理生化试验

2.3 产酸速率实验

作为产品优良发酵剂乳酸菌菌株的检测指标之一，快速的菌株产酸速率能有效增强菌株的抑菌性、加速产品风味的形成、提高产品凝胶性能及促进产品色泽形成等。研究结果表明:5株植物乳杆菌和3株戊糖片球菌显示了更快的产酸速率(图1和图2所示)，在30℃，16 h和24 h内分别使pH迅速降至4.0以下，且产酸速率没有显著差异(P≥0.05)，食品乳杆菌、明串珠菌和干酪乳杆菌的产酸速率明显低于植物乳杆菌和戊糖片球菌(P≤0.05)。

图1 5株典型乳酸菌30℃的产酸率

2.4 耐食盐，耐亚硝盐实验

制作肉制品发酵剂所选用的菌株，根据Smith和Palumbo［7］的报道，耐受6%的食盐和100 mg/L的亚硝盐是作为适合肉制品发酵剂的特性之一，它们在提高产品贮藏性、抑制有害微生物、稳定肉制品色泽及促进产品风味形成方面发挥着重要的作用。根据比浊法原理，以菌株在MRS液体培养基中OD值的变化，作为微生物生长指标，研究菌株的耐盐和耐亚硝酸盐特性。试验结果如表4所示。

表4 湘西传统酸鱼分离的乳酸菌在耐食盐、亚硝酸盐浓度

由表4可得出，所有菌株均能耐受4%的食盐浓度，68.3%植物乳杆菌、52.7%戊糖片球菌及38.5%食品乳杆菌能耐受6%的食盐浓度，所有的菌株均不能耐受10%的食盐浓度。85.5% 植物乳杆菌、81.1% 戊糖片球菌能耐受150 mg/mL的亚硝盐。

2.5 耐酸及耐胆盐实验

发展新型功能性的发酵肉制品，要求足够数量能耐受胃酸和胆汁环境的益生菌。因而，依据菌种特性和筛选标准，我们对传统酸鱼中存在的能耐受模拟胃肠道环境的乳酸菌进行了探讨、分析和筛选。由表5能够得出:41.3% 植物乳杆菌、37.6%戊糖片球菌及21.3%食品乳杆菌能耐受pH 2.5的胃酸环境2 h以上，活菌存活数量均达到106CFU/mL，而其余菌株的活菌数量大多在102－104CFU/mL，人体胃酸pH值一般在1.5～4.5之间，据此可得出，传统酸鱼中存在部分能耐胃酸的优质乳酸菌。实验结果表明:21.7%植物乳杆菌、18.3% 戊糖片球菌及11.4% 食品乳杆菌能耐受0.3%的胆盐4 h，活菌存活数量保持在107CFU/mL水平，其余菌株的存活数量仅有102～103CFU/mL，人体小肠中胆盐的含量一般在0.03～0.3之间，且食物在小肠中的停留时间大多在1～4 h，由此可知:传统酸鱼中存有部分能耐受0.3%胆盐的乳酸菌株。其中，5株植物乳杆菌和3株戊糖片球菌具有较好的耐受胃酸和胆盐能力。

表5 湘西传统酸鱼分离的乳酸菌耐酸、胆盐特性

2.6 抑菌性实验

乳酸菌的大量繁殖，乳酸的酸化和菌株产生细菌素抑制食品腐败菌和致病菌产生。因而，研究传统酸鱼制品优势乳酸菌的抑菌性试验也为我们提供了筛选酸鱼优良发酵剂的理论和实践依据。在分离的乳酸菌株中，82.4%植物乳杆菌、87.7% 戊糖片球菌、81.2% 食品乳杆菌、74.6% 明串珠菌和100% 干酪乳杆菌产生抑制大肠杆菌的抗菌物质。92.5% 植物乳杆菌、93.2% 戊糖片球菌、88.1% 食品乳杆菌、90.3% 明串珠菌和100% 干酪乳杆菌产生抑制金黄色葡萄球菌和李斯特杆菌的抗菌物质。分离的3株肠球菌均不能抑制大肠杆菌。其中，4株植物乳杆菌和3株戊糖片球菌的抑制3种指示菌株的抑菌圈都在10 mm以上(表6所示)。

表6 湘西传统发酵酸鱼分离的乳酸菌株抑菌性

2.7 氨基酸脱羧酶实验

发酵肉制品中的部分乳酸菌具有氨基酸脱羧酶活性，尤其在低pH值和高水分含量的条件下，它们往往脱羧某些特定的氨基酸，生成酪胺、组胺、尸胺、腐胺及苯基乙胺。这些化合物不仅劣化了食品的风味，而且对人体的健康会产生严重的危害。因而，研究传统酸鱼中的乳酸菌是否具有氨基酸脱羧酶活性，对了解酸鱼的安全品质及产品是否具备推广价值具有十分重要的意义。根据表7所示:在分离的196株乳酸菌株中，仅有1株植物乳杆菌、2株 肠球菌、1株明串珠菌具有氨基酸脱羧酶活性。

表7 湘西传统酸鱼分离的乳酸菌氨基酸脱羧酶活性

3 结论

(1)从湘西传统酸鱼共中分离出196株乳酸菌，并对其进行了鉴定，发现植物乳杆菌和戊糖片球菌是主要的优势菌株。

(2)分别对196株乳酸菌株进行生理生化、产酸速率、耐盐及亚硝酸盐、耐酸、耐胆盐、抑菌性、氨基酸脱羧酶及生长曲线的菌株特性研究。

(3)实验发现3株植物乳杆菌(Lp-7，Lp-10，Lp-21)和1株戊糖片球菌(Pp-27)具有产酸速率快，耐盐、耐酸、耐胆盐、无氨基酸脱羧酶活性，适合开发成淡水鱼发酵制品发酵剂的潜力。

［1］Hammes W P，Haller P，Ganzle M G.Fermented meat In Handbook of fermented functional foods，Farnworth，W R(ed)［M］.Boca Raton，FL:CRC Press，2003:251－275.

［2］车科，麻成金，黄群，等.湘西传统酸肉乳酸菌分离、筛选及鉴定［J］.中国酿造，2008，188:25－28.

［3］凌代文.乳酸菌分类鉴定及试验方法［M］.北京:中国轻工业出版社，1999:117－129.

［4］Salim Ammor，Eric Dufour，Monique Zagorec.Characterization and selection of Lactobacillus sakei strains isolated from traditional dry sausage for their potential use as starter cultures［J］.Food Microbiology，2005，22:529－538.

［5］Pennacchia C，Ercolini D，Blaiotta G.Selection of Lactobacillus strains from fermented sausages for their potential use as probiotics［J］.Meat Science，2004，67:309－317.

［6］Mauriello G，Casaburi A，Blaiotta G.Isolation and technological properties of coagulase negative staphylococci from fermented sausages of Southern Italy ［J］.Meat Science，2004，67:149－158.

［7］JL Smith，SA Palumbo.Use of Starter Cultures in Meats［J］.Journal of Food Protection，1983，46:997－1 006.