孙洁心，张永忠

1(黑龙江农垦职业学院，黑龙江 哈尔滨，150025)2(东北农业大学应用化学系，黑龙江哈尔滨，150030)3(教育部大豆生物学重点实验室，黑龙江哈尔滨，150030)

大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物，分为3类，即黄豆苷类(daidzin groups)、染料木苷类(genistin groups)、黄豆黄素苷类(glycitin groups)，以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型等4种形式存在［1－2］。大豆异黄酮中97%～99%是以大豆异黄酮糖苷形式存在，苷元形式仅为大豆异黄酮总量的1% ～3%［3］。从20世纪80年代起，很多研究报道及动物实验表明，大豆异黄酮具有许多突出的生物学功能［4－5］，如弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性等，能有效预防和抑制骨质疏松、乳腺癌、前列腺癌等多种疾病的发生［6－8］。然而，研究表明，这些功能主要来自于苷元形式的大豆异黄酮［9］，糖苷形式的大豆异黄酮只有在肠道微生物作用下降解为有活性的苷元形式，才能发挥其生理功能［10］。但肠道内微生物的水解作用很弱，因此，开发高活性的大豆异黄酮苷元类产品一直是国内外研究的热点。国内市场上，大豆异黄酮保健品中活性成分多为糖苷形式，较高生物活性的异黄酮苷元类深加工产品尚未见到［11－12］。

游离型苷元——染料木黄酮和黄豆苷元的制备常常采用水解的方法［13－15］。国外主要研究酶水解的方法，酶水解具有条件温和、苷元不易变性等优点。本课题组进行了糖化酶水解大豆异黄酮的研究，并与黑曲霉β-葡萄苷酶水解大豆异黄酮相比较，其水解效率相差不多。但目前国内市场上并没有β-葡萄苷酶产品出售，而糖化酶早已实现工业化生产，其市场价格十分低廉，易于用于大规模苷元型大豆异黄酮的生产。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

30%大豆异黄酮粉，黑龙江省粮食研究所;糖化酶，北京奥博星生物技术公司;染料木黄酮、黄豆苷元、染料木苷和黄豆苷标准品，sigma公司;甲醇为色谱纯;冰醋酸等为国产分析纯试剂。

1.2 仪器

HZS-H水浴振荡器，哈尔滨东明医疗仪器厂;PHS-25型pH计，上海精科雷磁仪器厂;AL104电子天平，上海天平仪器厂;高效液相色谱仪，P682HPLC泵，UVD170U紫外检测器，ASI-100自动进样器、色谱柱 Nova-Pak C18柱(3.9 mm ×150 mm，4 μm)，美国戴安公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色谱法检测大豆异黄酮含量

测定条件:流动相为V(甲醇)∶V(0.5%乙酸)=40∶60，柱温 50℃，流速 1.0 mL/min，检测波长 254 nm，进样量10 μL。

标准曲线的绘制:分别准确称取标准品染料木苷(genistin)和黄豆苷(daidzin)各1 mg、染料木黄酮(genistein)和黄豆苷元(daidzein)各5 mg，用甲醇(色谱纯)分别定容到10 mL容量瓶中，制成标准储备液。然后分别从各标准储备液中吸取一定量，用甲醇稀释到 1 μg/mL、2 μg/mL、3 μg/mL、4 μg/mL、5 μg/mL待测。以峰面积(y)为纵坐标，大豆异黄酮浓度(x)为横坐标，对各组分浓度与峰面积关系进行回归分析，并绘制标准曲线。

1.3.2 酶活力测定

1 g酶粉在40℃、pH值为4.6条件下，每小时分解2%的可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位。

1.3.3 酶水解反应体系与水解效率测定方法

向250 mL锥形瓶中加入30%大豆异黄酮粉后，加入糖化酶，然后加入150 mL某一pH值的乙酸－乙酸钠缓冲溶液，在一定温度下，水浴振荡器中进行水解反应。将反应液在80～90℃加热5 min，使酶灭活。经HPLC检测以染料木苷水解率为检测指标，计算水解率:

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 酶的添加量

向10只250 mL锥形瓶中各加入100 mg大豆异黄酮粉后再分别加入 10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70 mg、80 mg、90 mg 和 100 mg 糖化酶，然后加入150 mL pH值为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，在58℃的水浴振荡器中水解24 h。确定反应体系中酶的添加量。

1.3.4.2 底物浓度的确定

向6只250 mL锥形瓶中分别加入100 mg、500 mg、1 000 mg、1 500 mg、2 000 mg 和2 500 mg 大豆异黄酮粉，加入100 mg糖化酶，然后加入150 mL pH值为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，在58℃的水浴振荡器中水解24 h。确定反应体系中底物的浓度。

1.3.4.3 酶水解反应的最佳pH值

向6只250 mL锥形瓶中各加入500 mg大豆异黄酮粉和100 mg糖化酶后，再分别加入150 mL pH值为3、3.5、4、4.5、5 和 5.5 的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，在58℃的水浴振荡器中水解24 h。确定反应体系的最佳pH值。

1.3.4.4 酶水解反应的最佳时间

向6只250 mL锥形瓶中各加入500 mg大豆异黄酮粉和100 mg糖化酶后，再加入150 mL pH值为4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，在58℃的水浴振荡器中分别水解 3、6、9、12、15、18 和21 h。确定反应体系的最佳时间。

1.3.4.5 酶水解反应的最佳温度

向6只250 mL锥形瓶中各加入500 mg大豆异黄酮粉和100 mg糖化酶后，再加入150 mL pH值为4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，在温度分别为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃的水浴振荡器中水解6 h。确定反应体系的最佳温度。

1.3.5 正交试验确定水解反应的最适反应条件

根据单因素试验结果，确定加酶量和底物浓度并选择水解时间、水解pH值和水解温度为影响因素，采用3因素3水平做正交试验设计，确定最佳的水解条件。因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表

确定最佳水解条件后，进行验证试验。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱法测定大豆异黄酮标准曲线(表2)

表2 标准曲线

2.2 糖化酶酶活力的测定

经测定糖化酶的酶活力为38 U/mg。

2.3 单因素试验

2.3.1 酶的添加量

以150 mL pH值为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液为介质，向100 mg大豆异黄酮粉中加入不同量的糖化酶，水解大豆异黄酮，水解效率如图1所示。

图1 酶添加量的影响

实验结果表明，随着酶添加量的增加，水解率不断的提高，当加酶量为 100 mg时，水解率可达86.80%。

2.3.2 底物浓度的确定

以150 mL pH值为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液为介质，添加不同质量的大豆异黄酮粉进行水解反应，水解效率如图2所示。

图2 大豆异黄酮浓度的影响

试验结果表明，在异黄酮粉的加入量为500 mg/150 mL时水解率达到最大，当大豆异黄酮粉加入量大于500 mg时会有异黄酮粉挂在反应容器器壁上，减小了提取率。

2.3.3 酶水解反应的最佳pH值

以150 mL不同pH值的乙酸-乙酸钠缓冲溶液为介质，加入500 mg大豆异黄酮及100 mg的糖化酶，水解大豆异黄酮，水解率如图3所示。

图3 水解pH值的影响

实验结果表明，水解率在pH值为4.5时最高。

2.3.4 酶水解反应的最佳时间

在其他条件一定的情况下，控制不同的水解时间，其大豆异黄酮的水解率如图4所示。

实验结果表明，随着水解时间的增加，水解率提高。水解18 h，水解率达到最大，为93.56%;当超过18 h，水解率反而下降。

2.3.5 酶水解反应的最佳温度

在其他条件都确定的情况下，控制不同的水解温度，水解效率如图5所示。

实验结果表明，在50℃水解，水解率达到了最大值，为96.69%。超过55℃，水解率显著降低，因为温度过高会使酶变性失活。

图4 水解时间的影响

图5 水解温度的影响

2.4 正交试验结果

根据单因素试验结果，确定加酶量和底物浓度，选择水解时间、水解pH值和水解温度为影响因素，采用3因素3水平进行正交试验，确定最佳水解条件。这里时间因素的选择是因为水解时间为6 h时与水解时间为18 h时水解率的差别不大，出于缩短时间，降低水解成本的考虑将，水解时间因素的水平定为5 h、6 h和7 h。结果见表3。

表3 正交实验结果分析表

通过对表3极差分析的结果可以看出，3因素对水解率的影响程度依次为B＞C＞A，影响大豆异黄酮水解效率的主要因素是水解时间，其次是水解温度。通过单因素试验和正交试验设计确定了糖化酶水解糖苷型大豆异黄酮的最佳水解工艺是:温度55℃，pH值4.8，时间7h。水解率可达到98.18%。

3 结论

本研究对糖化酶水解糖苷型大豆异黄酮的加酶量、底物浓度、pH值、时间和温度进行了单因素试验，并以单因素试验的结果为依据，以pH值、时间和温度为因素进行了3因素3水平的正交实验。确定了糖化酶水解大豆异黄酮的最佳条件为:水解温度55℃，pH值4.8，时间7h。水解率可达98.18%。

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