闫晓笑 韩冲芳 范作雷 李婧

有研究表明，NF-κB和TNF-α诱导参与炎症反应，是心肌缺血再灌注损伤的重要原因［1，2］。七氟烷预处理可通过抑制NF-κB的活性，下调炎症细胞因子TNF-α的表达水平，减轻心肌缺血灌注的炎症反应，发挥心肌保护作用［3］。七氟烷后处理对心肌有保护作用［4，5］，但其机制还未完全阐明。因此，本实验通过建立大鼠心肌缺血再灌注模型，观察不同浓度的七氟烷后处理对大鼠心肌组织的NF-κB和血清中TNF-α的影响，探讨其减轻心肌缺血再灌注损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 动物选择与分组 健康Wistar雄性大鼠40只，体重180～220 g，由山西医科大学生理实验室提供。随机分为5组(n=8):假手术组(C组)、缺血再灌注组(I/R组)、1.0%、2.0%、3.0%七氟烷后处理组(S1、S2、S3组)。P组仅穿线不结扎左冠状动脉前降支(LAD)维持150 min。I/R组结扎30 min，再灌注120 min。S1、S2、S3组在再灌注前 15 min 分别吸入1.0%、2.0%、3.0%七氟烷(丸石制药株式会社)，其余操作同I/R组。

1.2 模型制备 参照文献［5］介绍的方法建立大鼠在体心肌缺血再灌注模型。200 g/L的乌拉坦0.5 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠后，仰卧位固定于鼠板，气管切开，连接动物呼吸机(潮气量10～15 ml/kg，呼吸频率60～70次/min，吸呼比1∶2)，连接生物定量分析系统记录心电图。在胸骨左缘0.5 cm，第3，4肋间暴露心脏。用7-0丝线在左心耳根部下方2 mm处进针，穿过心肌表层肺动脉圆锥稍下方处穿线，丝线两端穿过聚乙烯小管(1.5～2.0 mm)，拉紧细线，用止血钳夹闭小管，即可阻断LAD。心电图示ST弓背向上抬高≥0.1 mV，结扎线下心肌组织发绀，说明心肌缺血模型成功。30 min后，松开止血钳，使LAD恢复血流，ST段下降1/2以上，发绀区逐渐变红，说明心肌已恢复再灌注。结扎前出现心电图不正常或未到观察终点而死亡的大鼠排除本研究。

1.3 标本采集 再灌注2 h后，腹主动脉抽血2 ml，置于抗凝管中，用低速离心机(3000 r/min)离心15 min，取上清液置于EP管中，-70℃保存，以备双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA法)测TNF-α含量。再灌注2 h后，剪下心肌组织，迅速分离出左心室，置于10%中性甲醛24 h后，石蜡包埋，切片，保存以备HE染色和免疫组化测NF-κB。

1.4 HE染色 石蜡切片脱蜡酒精水化，苏木素液复染，1%盐酸乙醇返蓝，伊红乙醇处理，脱水，透明，封片，光镜下观察心肌组织的病理形态学变化。

1.5 测NF-κB 石蜡切片脱蜡酒精水化，枸橼酸修复，3%H2O2室温封闭10 min，PBS缓冲液冲洗，滴加一抗Rabbit Anti-NFkBp65(北京博奥森生物技术有限公司)，4℃过夜。PBS冲洗，滴加PV-6001/6002/6003两步法免疫组化试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)，10 min后，PBS冲洗，滴加DAB显色剂，镜下观察终止显色。流水冲洗，苏木素液复染，1%盐酸乙醇返蓝，常规脱水透明封片。光镜下观察，阳性反应为细胞浆和(或)细胞核呈棕黄色。每张切片随机选取5个视野，利用图像分析系统分析阳性区域平均光密度值，代表NF-κB的活性表达水平。

1.6 测TNF-α 按照 Rat TNF-α ELISA Kit试剂(北京四正柏生物科技有限公司)说明书检测血清中TNF-α的含量。在450 nm下测OD值，TNF-α浓度与OD450值之间呈正比，绘制标准曲线计算标本中TNF-α浓度(pg/ml)。

1.7 统计学方法 用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌组织的病理形态学变化 光镜下观察心肌组织病理变化。C组心肌细胞排列整齐，呈束状，细胞形态正常，细胞间质无水肿。I/R组心肌细胞排列紊乱，细胞肿胀明显，细胞间质水肿明显。S1、S2组心肌病理变化基本相同，介于I/R组和S2组间。S2组心肌细胞排列基本整齐，细胞轻度水肿，部分细胞间质水肿轻度增宽。

2.2 各组NF-κB的变化 与C组相比，I/R组、各 S组NF-κB的活性显著升高(P＜0.05);与I/R组相比，各S组NF-κB的活性显著降低(P＜0.05);S1组与S3组各指标间无明显差异(P ＞0.05);与 S1组、S3组相比，S2组 NF-κB 的活性显著降低(P＜0.05)(表1)。

2.3 各组TNF-α的变化 与C组相比，I/R组、各S组TNF-α浓度显著升高(P＜0.05);与I/R组相比，各S组TNF-α浓度均显著降低(P＜0.05);S1组与S3组各指标间无明显差异(P ＞0.05);与 S1组、S3组相比，S2组 TNF-α 浓度显著降低(P＜0.05)(表1)。

表1 各组大鼠TNF-α浓度、NF-κB活性的比较(±s)

表1 各组大鼠TNF-α浓度、NF-κB活性的比较(±s)

注:与C组相比，aP＜0.05;与 I/R组相比，bP＜0.05;与S1和S3组相比，cP＜0.05

组别 n TNF-α(pg/ml) NF-κB C组843.49±4.20 0.20±0.01 I/R组 8 83.72±5.51a 0.37±0.15a S1组 8 76.13±6.21ab 0.33±0.01ab S2组 8 68.94±6.63abc 0.28±0.01abc S3组 8 75.58±6.59ab 0.32±0.02ab

3 讨论

本实验参照文献［5］采用结扎左冠状动脉前降支30 min，恢复血流120 min的方法制备心肌缺血再灌注模型，结果表明，I/R组NF-κB的活性及TNF-α浓度较C组显著升高，结合心电图和病理学结果，提示模型制备成功。参照文献［6］采用1.0%、2.0%、3.0%作为七氟烷浓度。

心肌缺血再灌注损伤是一个作用机制复杂的病理生理过程。有研究表明，抑制炎症反应可减轻心肌缺血再灌注损伤［1］。TNF-α是一个多功能性的细胞因子，在炎症反应过程中发挥着重要作用，是其他炎症细胞因子的上游诱导者，引起细胞因子的级联反应，导致心肌缺血再灌注损伤［7］。本实验结果显示，与C组相比，I/R组TNF-α浓度显著升高;与I/R组相比，七氟烷后处理组(S1、S2和S3组)血清 TNF-α的表达和产生明显降低，提示七氟烷后处理抑制TNF-α的产生，减轻炎症反应，来保护心肌损伤。

NF-κB是广泛存在于多种细胞中的核转录因子，诱导促炎细胞因子TNF-α的表达，发生炎症反应［8］。许多研究证实，心肌缺血再灌注能够诱发NF-κB活化，并且NF-κB活化及其诱发的炎症级联反应可促进心肌损伤的发生［1，2，9］。本实验I/R组NF-κB的活性及TNF-α的浓度明显升高支持这一点。而下调NF-κB的活性，则可抑制TNF-α等促炎性因子的过度表达，抑制炎症反应，减轻心肌损伤［3］。结果表明，与I/R组相比，S1组、S2组和S3组大鼠心肌组织NF-κB的活性降低，血清TNF-α的表达降低，提示七氟烷后处理可通过抑制NF-κB的活性，降低TNF-α的表达水平，从而减轻心肌缺血灌注的炎症反应，是其后处理的保护作用机制之一。但七氟烷后处理通过何种途径激活NF-κB的活性，有待进一步探讨。

研究结果表明，S2组NF-κB活性及TNF-α浓度较S1组、S3组相比显著降低，而S1组、S3组相比各指标间无明显差异，提示浓度为2.0%的七氟烷对心肌的保护效果最佳。

综上所述，七氟烷后处理可通过抑制大鼠心肌组织中NF-κB的活性，降低血清TNF-α的表达水平，达到心肌保护作用，且浓度为2.0%的效果最佳。

［1］Ke JJ，Yu FX，Rao Y，et al.Adenosine postconditioning protects against myocardial ischemia-reperfusion injury though modulate production of TNF-α and prevents activation of transcription factor NF-kappaB.Mol Biol Rep，2011，38(1):531-538.

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