李宏云 陈世益 张健 李云霞

复旦大学运动医学中心 复旦大学附属华山医院运动医学与关节镜外科（上海200040）

骨骼肌损伤是运动医学中常见的损伤之一，占运动损伤的10%～50%[1]。骨骼肌损伤后再生能力有限，结构及功能恢复常常不完全，愈合缓慢，并伴有一定程度的纤维化，易再次发生损伤。研究发现，中药黄芪丹参复方注射液在形态学上可加快骨骼肌损伤愈合，促进肌球蛋白重链的表达和合成，抑制胶原纤维合成，增强骨骼肌收缩力[2-4]。然而，黄芪丹参复方制剂组成成分繁杂，作用机制尚未完全明确，阻碍了其在骨骼肌损伤治疗中的大规模临床应用和国际化推广。黄芪皂甙和丹参酮ⅡA是黄芪和丹参的重要组成成分，我们前期的研究工作已表明急性骨骼肌钝挫伤修复过程中，黄芪皂甙和丹参酮ⅡA能有效地促进胚胎型肌球蛋白重链 （embryonic Myosin Heavy Chain，MHC-emb）mRNA 的表达，同时抑制波形蛋白（vimentin）mRNA的表达，联合注射作用与黄芪丹参复方注射液效果相似[5]。但是，由于组织功能的执行者是蛋白质，从mRNA到蛋白质还需要翻译过程。因此有必要进一步了解该药对MHC-emb和vimentin蛋白表达水平的影响，来充分了解黄芪皂甙和丹参酮ⅡA在骨骼肌损伤修复过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

体重180～200g雄性Wistar大鼠80只 [中国科学院上海实验动物中心提供，许可证号:SCXK（沪）2007.0005]，按国家标准啮齿类动物饲料饲养于复旦大学动物试验部，自由摄食饮水，动物房温度21～23℃，相对湿度 40%～60%。

1.2 骨骼肌钝挫伤模型建立

大鼠麻醉后（戊巴比妥钠，50 mg/kg体重，腹腔注射），参照Kami等[6]的大鼠骨骼肌急性钝挫伤模型制作方法，将大鼠右侧后肢置于伸膝、踝背屈90°位置上，用重约335 g的重物自80 cm高处落下，落至V形塑料制圆锥体打击器上，打击大鼠后肢小腿腓肠肌中段内侧面（距跟骨约1.15 cm处，打击动能为2.646 J，打击面积约0.65 cm2）。受伤局部皮肤完好，解剖证实骨骼肌钝挫伤造模成功率达100%。

1.3 动物分组

80只大鼠随机分成A组 （黄芪皂甙组）、B组（丹参酮ⅡA组）、C组（丹参酮ⅡA+黄芪皂甙组）、D组（黄芪丹参注射液组）、E组（生理盐水对照组）。大鼠骨骼肌损伤后即刻，按不同分组，分别于损伤部位皮下（肌膜外）注射黄芪皂甙（A 组）（5 mg/ml）、丹参酮ⅡA（B 组）（5 mg/ml）、黄芪皂甙丹参酮ⅡA 等体积混合液（C组）、黄芪丹参等体积混合液（D组）及生理盐水（E组），注射量均为1 ml/只/次。以后每隔3天注射1次，直到损伤后第27天。

1.4 处死取材

于右下肢钝挫打击伤后第4天、7天、14天和28天，分别从各组中随机取4只大鼠，脱颈处死后进行右下肢腓肠肌损伤部位取材。完整取出右下肢腓肠肌后，立即将标本储存于液氮中待用。

1.5 Western Blot检测

运用Western Blotting法检测MHC-emb和vimentin蛋白表达水平:①组织蛋白的抽提:切取约100 mg组织样品，每样本加入1 ml的T-PER试剂，电动匀浆器进行组织匀浆，离心5分钟后收集上清液；②使用BCA法进行总蛋白定量:分别吸取0.1 ml的标准品和未知样品至各自管中，每管加入2 ml WR，并混匀，37℃30 min孵育，光度计检测各管吸收，制作标准曲线，利用标准曲线得出各未知样品的蛋白浓度；③SDS－PAGE电泳:玻璃板上制胶后将样品加入离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1倍。取10 μl蛋白样品加入电泳，分离后进行转膜；④转膜:将PVDF膜切成与凝胶尺寸大小一致，置于甲醇中浸透10秒钟，立即转入转膜液中平衡20分钟；用三张滤纸贴于两张多孔垫料，将PVDF膜、胶夹于中间。PVDF膜朝正极，400 mA转膜120 min后用立春红染色；⑤杂交:PVDF膜常温封闭2小时并冲洗后，加入一抗，分别为 MHC-emb （mouse anti-rat，1∶1000 稀释，Ab-cam 公司，美国）；vimentin（rabbit anti-rat，1∶1000 稀释，Abcam公司，美国），4℃过夜；TBST洗膜3次后，加入二抗，分别为 MHC-emb（anti-mouse，1∶5000 稀释，Cell Signaling 公司，美国），vimentin（anti-rabbit，1∶3000 稀释，Cell Signaling 公司，美国），室温反应 1小时后TBST洗膜3次。⑥检测:采用化学发光试剂（PierceRECL Western Blotting Substrate，Thermo 公司，美国）进行检测。采用复日FR-980生物电泳图像分析系统（上海复日科技有限公司，中国）摄像分析，以目的蛋白条带的相对吸光度值 （与GAPDH吸光度值的比值）作为目的蛋白的相对含量。

1.6 统计学分析

采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行分析，采用TWO-WAY ANOVA方法进行检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中药黄芪皂甙与丹参酮ⅡA对大鼠急性钝挫伤后MHC-emb蛋白表达的影响

骨骼肌急性钝挫伤后，MHC-emb蛋白表达即开始升高，伤后14天达到峰值，之后逐渐下降，一直持续到伤后28天；与生理盐水组相比，各干预组MHC-emb表达均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），这种情况一直持续到伤后28天；其中又以C组和D组升高最为明显，且C组和D组的高峰在伤后 21天才出现（图 1，表1）。

2.2 中药黄芪皂甙与丹参酮ⅡA对大鼠急性钝挫伤后vimentin蛋白表达的影响

骨骼肌急性钝挫伤后，vimentin蛋白表达即开始升高，伤后14天升高最为明显，一直持续到伤后28天，仍然维持在一个较高的水平；与生理盐水组相比，干预组vimentin表达较对照组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），这种情况一直持续到伤后28天；其中又以C组和D组降低最为明显（图2，表2）。

3 讨论

3.1 活血化淤中药在骨骼肌钝挫伤后修复过程中的作用

黄芪、丹参是两味传统中药，具有改善微循环、稳定细胞膜、抗纤维化、促进创伤修复等作用，被广泛应用于心脑血管系统疾病的治疗。研究发现黄芪丹参类活血化淤中药能够促进骨骼肌损伤后的修复，不但能够促进肌肉再生指标肌球蛋白重链（MCH）的表达增高并提前合成，而且还能降低纤维化指标 I、III型胶原合成[2]。生物力学研究发现，应用黄芪丹参后3周，损伤骨骼肌的最大颤搐张力、断裂强度及拉伸形变能力较自然愈合组明显改善[4]。肌电图评价也证实，此类中药能够明显加速损伤骨骼肌愈合过程中异常肌电信号的消失，促进肌电恢复，提高愈合质量[3]。

表1 各干预组MHC-emb/GAPDH值（±s，n=4）

表1 各干预组MHC-emb/GAPDH值（±s，n=4）

*P<0.05:与生理盐水组同一时间点相比较，#P<0.05:与黄芪丹参组同一时间点相比较。

A?????B????IIA C????????IIA D?????E?????Day 4 0.15–0.04 0.17–0.06 0.31–0.18 0.30–0.08 0.08–0.09 Day 7 0.39–0.09 0.41–0.17 0.48–0.12 0.48–0.09 0.27–0.08 Day 14 0.37–0.05 0.41–0.10 0.54–0.17 0.57–0.11> 0.31–0.06 Day 28 0.27–0.07 0.31–0.04 0.49–0.10 0.53–0.06 0.14–0.05

表2 各干预组Vimentin/GAPDH值（±s，n=4）

表2 各干预组Vimentin/GAPDH值（±s，n=4）

*P<0.05:与生理盐水组同一时间点相比较，#P<0.05:与黄芪丹参组同一时间点相比较。

E?????Day 4 0.27–0.03*# 0.28–0.04*# 0.18–0.04* 0.14–0.03* 0.35–0.07 Day 7 0.40–0.05*# 0.38–0.05*# 0.26–0.03* 0.28–0.06* 0.45–0.06 Day 14 0.55–0.14*# 0.54–0.11*# 0.42–0.05* 0.40–0.08* 0.65–0.13 Day 28 0.47–0.09*# 0.45–0.04*# 0.35–0.08* 0.31–0.04* 0.54–0.05 A?????B????IIA C????????IIA D?????

虽然已经证实中药黄芪丹参复方注射液可以促进骨骼肌损伤修复，但是这些中药复合物成分较为复杂，在促进骨骼肌损伤愈合过程中何种药物发挥作用具体仍不清楚。这将影响中药在运动医学领域应用的合理性，限制其在更广层面的推广和应用。随着中药现代化的进程，目前针对中成药中的部分组成部分的研究正在逐步开展。黄芪皂甙、丹参酮ⅡA分别是黄芪和丹参的主要有效成分，在某些研究领域其作用效果与各自复合物相差无几[7-10]，甚至在心脑血管临床应用上已经开始逐渐替代其复合物。因此本研究选用黄芪皂甙、丹参酮ⅡA两种单体作为主要研究对象，进一步探讨活血化淤中药对大鼠骨骼肌钝挫伤后vimentin和MHC-emb表达的影响，进一步研究它们治疗骨骼肌损伤的效果。在前期研究工作中，我们已经证实:在急性骨骼肌钝挫伤修复过程中，黄芪皂甙、丹参酮IIA能促进MHC-emb mRNA表达，抑制波形蛋白mRNA表达，与黄芪丹参混合使用效果与黄芪丹参基本一致。但这只是基因转录层面的观察结果，组织器官中的功能执行者是蛋白质，从mRNA到功能蛋白还需要经过翻译的过程，mRNA的升高并不代表功能蛋白的表达一定会升高。因此，还需了解在肌肉损伤修复过程中MHC、波形蛋白的蛋白表达水平的变化，进一步评价黄芪皂甙、丹参酮ⅡA在骨骼肌损伤后修复过程中的作用[5]。本研究的内容即是从蛋白水平了解黄芪皂甙、丹参酮ⅡA在骨骼肌损伤修复中对emb-MHC和波形蛋白的影响。研究结果也证实，黄芪皂甙、丹参酮IIA能促进MHC-emb表达，抑制波形蛋白表达，联合应用效果更佳，作用近似于复方成分，与mRNA表达的变化趋势基本一致。

3.2 胚胎型肌球蛋白重链与波形蛋白在骨骼肌急性钝挫伤伤后表达的意义

骨骼肌损伤的愈合包括急性反应期、修复期和重塑型期三个时期[11，12]。骨骼肌的修复开始于伤后7－10天，伤后2周达到高峰，3－4周开始下降。骨骼肌的再生有赖于成肌细胞的活化，它们可以通过增殖、增生、分化、融合，最后形成新肌管，最终形成肌纤维。骨骼肌损伤修复过程中肌球蛋白重链的表达会明显升高。与骨骼肌发育过程相似，肌球蛋白重链也按胚胎型、新生型及成年型的顺序表达[13]。MHC-emb在骨骼肌再生的过程中最早表达，更能精确地代表新生骨骼肌的数量。因此，本研究选择检测MHC-emb在骨骼肌损伤后的表达，以期更为精确地了解骨骼肌的再生情况。在本研究中发现，MHC-emb一般在伤后14天时达到高峰，之后慢慢下降，这与以往的研究相符。而且我们也发现，黄芪皂甙与丹参酮ⅡA联合应用后，不仅可提高MHC-emb的表达，而且表达的高峰一直延迟到伤后3周才出现，表明这两种中药联合应用可能会延长新生骨骼肌的再生时间，从而进一步促进骨骼肌损伤愈合。

vimentin（波形蛋白）是中间纤维家族蛋白的一员，它与微管、微丝一起构成细胞骨架。尽管大多数中间纤维是相对稳定的结构，但在成纤维细胞中波形蛋白以一种动态结构存在。vimentin作为间质组织纤维化的主要标志物，广泛应用于检测骨骼肌损伤修复过程中的纤维化[14-16]。通常在骨骼肌损伤后vimentin表达越高，表明纤维化情况越重，越不利于骨骼肌的修复。因为过多的纤维化组织会形成大量的疤痕，疤痕形成的机械屏障会抑制整个损伤区域骨骼肌的完全再生[17]，因此，有必要抑制骨骼肌损伤后纤维化的表达来促进骨骼肌损伤愈合的质量。骨骼肌损伤后纤维化的发生要稍晚于修复启动，一般在伤后10～14天开始，伤后18到21天时达到高峰[15]。我们在实验中也观察到，各实验组vimentin的表达高峰一般在伤后3周出现，这与以往的研究结果也相符。黄芪皂甙与丹参酮IIA联合具有良好的抑制vimentin表达的作用，其抑制能力与中药复方成分基本一致。

目前已证实，黄芪丹参注射液在骨骼肌损伤修复过程中能够改善局部微循环，促进损伤局部的修复。而黄芪皂甙与丹参酮IIA在骨骼肌急性钝挫伤后能够抑制氧化应激反应，减轻骨骼肌损伤[18，19]。 当然，黄芪皂甙、丹参酮IIA是如何促进MHC-emb表达，抑制波形蛋白的表达，尚需进一步研究。

4 总结

在急性骨骼肌钝挫伤修复过程中，黄芪皂甙、丹参酮IIA均能促进MHC-emb表达，抑制波形蛋白表达，联合使用时效果与黄芪丹参复方成分基本一致。

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