曹艳妮，刘通讯

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

普洱生茶和熟茶香气中萜烯类和甲氧基苯类成分分析

曹艳妮，刘通讯

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

采用同时蒸馏萃取法（SDE）提取，经GC-MS联用测定不同储存时间普洱生茶和熟茶的香气成分。实验结果表明：萜烯类和甲氧基苯类化合物是普洱茶香气的主要成分。其中的萜烯类化合物主要以单萜类及其含氧衍生物为主，还含有部分倍半萜类及其含氧衍生物、类胡萝卜素及紫罗兰酮的氧化降解产物；甲氧基苯类化合物以1，2，3-三甲氧基苯、1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯为主。

普洱茶，萜烯类，甲氧基苯类，储存时间，香气成分

萜类化合物（terpenoids）是一类由甲戊二羟酸（mevalonic acid，MVA）衍生而成，基本碳架多具有2个或2个以上异戊二烯单位结构特征的化合物[1]，广泛分布于植物细胞中。单萜是最常见的萜烯类化合物，茶叶中常见的单萜大都带有浓郁的甜香、花香和木香，如芳樟醇具有百合花香或玉兰香，α-松油醇具有丁香，香叶醇具有温和调谐的蔷薇香，橙花醇具有轻柔的甜润香。它们含量的高低以及协调作用在一定程度上左右着茶叶的香气特征。除了萜烯类物质以外，甲氧基苯类作为普洱茶中另一主要组分备受关注，尤其在经过后发酵的普洱熟茶中含量丰富。许多研究认为，这些物质赋予普洱茶典型霉味和陈香[2]，是普洱茶沉香甘醇的主要原因。本文采用SDE-GC-MS联用分析法测定了不同储存时间的五种普洱生茶和五种普洱熟茶的香气成分，着重比较了普洱生茶和熟茶中萜烯类和甲氧基苯类的化学组成、含量差异，以及各种成分随储存时间的变化而产生的差异。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

普洱熟茶和生茶 中国云南西双版纳勐海国营黎明茶厂2009、2007、2005、2003、2001年出品，共10个样品；二氯甲烷、无水硫酸钠 均为分析纯。

Trace DSQⅡGC/MS气相色谱-质谱联用仪 美国Thermo fisher公司；HP-5弹性石英毛细管柱（30m× 0.25mm，0.25μm） 美国安捷伦科技公司；KQ5200DE型超声波清洗器 频率为25kHz；氮吹仪，同时蒸馏萃取器，电热套。

1.2 实验方法

1.2.1 同时蒸馏-萃取法（SDE）提取香气成分 准确称取普洱茶样品50g置于1000mL圆底烧瓶中，加入200mL去离子水浸泡，接至同时蒸馏-萃取装置的一端，控制温度保持微沸状态。另取二氯甲烷30mL置于250mL单颈圆底烧瓶中，接在同时蒸馏-萃取装置的另一端，用电热套加热，两边达到平衡回流稳定后，保持萃取2h，二氯甲烷萃取液用无水硫酸钠脱水干燥，然后用氮吹仪挥发溶剂，浓缩得1mL具有浓郁香味的淡黄色透明液体，过0.45μm膜，用气质联用仪进行检测。

1.2.2 GC-MS色谱条件 气相色谱条件：GC条件：采用HP-5MS弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；进样口温度为220℃；载气为高纯氦气，纯度gt;99.999%，流速1mL/min；柱温起始为50℃，以5℃/min速度升至150℃，保持2min，以5℃/min速度升至180℃，保持2min，再以5℃/min速度升至230℃，保持7.5min，最后以3℃/min速度升至280℃，保持5min；分流比：10∶1进样。质谱条件：轰击电子能量：70eV，电子源电离方式：EI，离子源温度：200℃，进样量：1μL，扫描范围：29～550amu，扫描方式：全扫描。

1.2.3 定性和定量方法 按上述分析条件对香气成分进行气相色谱-质谱分析，将各色谱峰对应的质谱图利用Wiley及NIST两个计算机谱库，对得到的质谱图进行串联检索，并与文献值对照相结合进行人工解析，再结合保留时间、质谱、实际成分和保留指数等参数，并参考有关茶叶芳香物质成分的分析结果（tR值）进行组分比较鉴定，并对部分成分进行标准物质对照，同时对总离子流量（TIC）用峰面积归一化定量，得到各组分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 普洱茶香气成分中萜烯类化合物组成分析

图1 五种生茶和五种熟茶中主要单萜类物质平均含量的比较Fig.1 Comparison of the main lerpenes components in five raw tea samples and five ripe tea samples

2.1.1 生茶和熟茶中主要萜烯类化合物比较分析 生茶萜烯类15种，其中单萜类7种、单萜类含氧衍生物5种，类胡萝卜素和紫罗酮降解产物2种、倍半萜含氧衍生物1种。熟茶萜烯类24种，其中单萜类6种、倍半萜醇1种、单萜类含氧衍生物10种、类胡萝卜素和紫罗酮降解产物4种、倍半萜含氧化合物3种。普洱茶香气成分中的萜类化合物主要以单萜类及其含氧衍生物为主，还含有部分倍半萜类及其含氧衍生物、类胡萝卜素及紫罗兰酮的氧化降解产物。其形成与长时间的堆积发酵及日光干燥中产生的氧化降解和光氧化作用有关。

生茶萜类化合物含量最高的前五种分别为芳樟醇吡喃氧化物（13.58%）、α-松油醇（10.13%）、1，2-环氧芳樟醇Ⅱ（7.10%）、芳樟醇（4.18%）、1，2-环氧芳樟醇Ⅰ（4.14%）；熟茶萜类化合物含量最高的前五种分别为芳樟醇吡喃氧化物（14.07%）、1，2-环氧芳樟醇Ⅱ（5.87%）、1，2-环氧芳樟醇Ⅰ（4.03%）α-松油醇（2.81%）、薄荷烯酮（1.32%）。

在普洱生茶所鉴定出来的7种单萜类化合物除香草醇外，其余6种在熟茶中都有检出。但是生茶与熟茶之间相对含量的平均值差异极其显著（图1）。除了薄荷醇的含量增加了48.71%以外，其余五种单萜类的含量都显著降低，分别降低了90.59%、69.28%、72.25%、77.87%、85.66%，即经历后发酵阶段后，茶叶中单萜类物质的损耗巨大。

2.1.2 不同储存时间的生茶和熟茶中主要单萜化合物比较分析 生茶中六种单萜类物质含量随储存时间的增加含量先减少，然后又呈现增加趋势（图2）。其中2007年、2005年的生茶各单萜类物质含量最低。笔者分析可能在采摘、揉捻、干燥的过程中生成了部分游离态的单萜化合物，该类物质化学性质活泼极易被氧化分解，故在刚出品后的两年随着储存时间的增加含量骤降，随后在生茶温和的后发酵过程中，又随着单萜类糖苷的降解而得到累积。对比2009年生茶和2001年生茶，除了4-萜烯醇以外，单萜类物质的含量仍然是减少的。芳樟醇、薄荷醇、α-松油醇、橙花醇、香叶醇的含量分别减少了0.93%、40.34%、25.36%、41.02%、60.73%，4-萜烯醇含量增加了70.94%。

图2 不同储存年份的生茶主要单萜类物质含量Fig.2 Comparison of the main lerpenes components in five raw tea samples with different storage time

熟茶中除了2003年茶样的薄荷醇，2005年、2007年茶样的橙花醇未检出外，六种单萜类物质含量随储存时间的增加，含量普遍呈现减小趋势（图3）。对比2009年熟茶和2001年熟茶，芳樟醇、薄荷醇、萜烯醇、α-松油醇、橙花醇、香叶醇的含量分别减少了76.67%、57.34%、13.89%、47.97%、63.37%、50.00%。

图3 不同储存年份的熟茶主要单萜类物质含量Fig.3 Comparison of the main lerpenes components in five ripe tea samples with different storage time

2.2 普洱茶香气成分中甲氧基苯类化合物组成分析

2.2.1 生茶和熟茶中主要甲氧基苯类化合物比较分析 生茶中鉴定出甲氧基苯化合物11种，熟茶12种，其中共有成分8种，分别是1，2-二甲氧基苯、3，4-二甲氧基甲苯、1，2，3-三甲氧基苯、4-乙基-1，2-二甲氧基苯、1，2，4-三甲氧基苯、1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯、乙酰丁香酮、5-烯丙基-1，2，3-三甲氧基苯。对比其在生茶和熟茶中的含量发现（图4），除3，4-二甲氧基甲苯、5-烯丙基-1，2，3-三甲氧基苯的含量分别降低了44.52%和13.23%以外，其它六种甲氧基苯类化合物的含量都显著增加，分别增加了98.5%、218.7%、140.4%、953.8%、89.6%、176.3%。

图4 五种生茶和五种熟茶中主要甲氧苯类物质平均含量的比较Fig.4 Comparison of the main methoxybenzene components in five raw tea samples and five ripe tea samples

生茶中甲氧基苯类化合物含量最高的3种分别是1，2，3-三甲氧基苯（8.40%）、1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯（3.83%）和3，4-二甲氧基甲苯（1.65%）。熟茶中甲氧基苯类化合物含量最高的3种分别是1，2，3-三甲氧基苯（26.76%）、1，2，4-三甲氧基苯（7.99%）、1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯（7.26%）。1，2，3-三甲氧基苯是生茶和熟茶中的甲氧基苯类含量最高的物质，这与洪涛[2]、吕海鹏[3]等的研究结果一致。

另外，生茶独有的3种甲氧基苯类化合物分别为1，3-二甲氧基苯酚、2，5-二甲氧基-苯甲醇、3，4，5-三甲氧基甲苯，且只在2005年和2003年的样品中检出。熟茶独有的5种甲氧基苯类化合物分别为4-丙基-1，2-二甲氧基苯、1，2，3，4-四甲氧基苯、1，2-二甲氧基-4-丙烯基苯、2，4，6-三甲氧基苯乙酮、3-甲氧基-2，5，6-三甲基苯酚。除了后两种在个别年份的茶样未检出，其余成分都有检出。在生茶和熟茶独有的甲氧基苯类化合物中，生茶的3，4，5-三甲氧基甲苯含量最高，熟茶的1，2，3，4-四甲氧基苯含量最高，平均含量分别为1.13%和1.57%。

2.2.2 不同储存时间的生茶和熟茶中主要甲氧基化合物比较分析 生茶中的甲氧基苯类化合物随着储存时间的增加，基本上呈现先增加后减小的趋势（图5），最具代表性的是1，2，3-三甲氧基苯和1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯。这两种甲氧基苯化合物的含量在2005年生茶样品中达到最高，2003年有所降低，2001年出现更大幅度的降低。具体原因有待进一步分析。

以熟茶中主要的7种甲氧基苯类化合物为例，其含量均出现较大波动，且变化趋势不一致（图6）。对比2009年熟茶和2001年熟茶，除了1，2–二甲氧基苯、1，2，4-三甲氧基苯含量降低以外（分别降低了34.85%、12.88%），3，4-二甲氧基甲苯、1，2，3-三甲氧基苯、1，2，3-三甲氧基-5-甲苯、乙酰丁香酮、1，2，3，4-四甲氧基苯的含量均增加，分别增加了25.37%、17.46%、375.27%、628.23%、6.29%。其中1，2，3-三甲氧基-5-甲苯和乙酰丁香酮的增幅最大。

图5 不同储存年份的生茶主要甲氧基苯类物质含量Fig.5 Comparison of the main methoxybenzene components in five raw tea samples with different storage time

图6 不同储存年份的熟茶主要甲氧基苯类物质含量Fig.6 Comparison of the main methoxybenzene components in five ripe tea samples with different storage time

3 讨论

研究发现，萜烯醇类和芳香醇类化合物主要以键合态糖甙形式作为香气前驱体存在于茶鲜叶中[5]，从茶叶中已分离鉴定了多种单萜烯醇的樱草糖甙和葡萄糖甙，包括顺-3-己烯醇、香叶醇、芳樟醉、2-苯乙醇、苯甲醇、芳樟醇氧化物Ⅰ、Ⅱ及水杨酸甲酯等香气组分[6-7]，这些游离态的萜烯类化合物直接或间接地经过立体专一性的二聚作用、环化和重排，由无环的前身所衍生[8]。川上美智子[9]研究认为，甲氧基苯类化合物的生成是由于普洱茶中的EGCG在氧化降解过程中脱没食子酰基形成没食子酸，而没食子酸的羟基（OH-）的氢被（-CH3）取代实现甲基化，则产生甲氧基苯的类似结构化合物。化工上，1，2，3-三甲氧基苯的制备方法通常是将焦性没食子酸（邻苯三酚）与烷氧基化试剂（如硫酸二甲酯）在碱性条件下反应[10]。1，2-二甲氧基苯也有愈创木酚（邻羟基苯甲醚）法和邻苯二酚法两种合成路线[11]。以上可作为甲氧基苯类的生物合成机理的参考。张春花[12]等的研究表明，普洱茶经四种微生物（黑曲霉、少根根霉、酿酒酵母、绿色木霉）发酵均生成大量的甲氧基苯类化合物，其中黑曲霉固态发酵的普洱茶甲氧基苯及其衍生物含量最高。本研究在生茶中鉴定出7.35%～30.39%的甲氧基苯类化合物，说明甲氧基苯类化合物的生成并不局限于渥堆后发酵阶段。甲氧基苯类的形成机理、在普洱茶加工各阶段的生成情况、微生物发酵的酶系和生化作用机理等还有待于进一步研究。

[1]沈朝烨，徐以盛，蒋志宏，等.室内空气中单萜类化合物检测方法的研究[C].2008年全国有机质谱学术会议论文集，2008.

[2]吕海鹏，钟秋生，王力，等.普洱茶加工过程中香气成分的变化规律研究[J].茶叶科学，2009，29（2）：95-101.

[3]洪涛，黄遵锡，李俊俊，等.普洱熟茶和生茶香气成分的提取和测定分析[J].茶叶科学，2010，30（5）：336-342.

[4]吕海鹏，钟秋生，林智.陈香普洱茶的香气成分研究[J].茶叶科学，2009，29（3）：219-224.

[5]夏涛，童启庆.茶叶香气前驱体研究进展[J].茶叶，1996，22（1）：14-17.

[6]Sakata K，et al.Relation of ST-segmeng changes in inferior leads during anterior wall acute myocardial infarction to length and occlusion site of the left anterior descending coronary artery [J].Am J Cardiol，2001，87：1340-1345.

[7]张正竹，宛晓春，陶冠军.茶鲜叶中糖苷类香气前体的液质联用分析[J].茶叶科学，2005，25（4）：275-281.

[8]川上美智子，小林彰夫，山西贞，等.堆积茶中国产砖茶和黑茶的香气特性[J].日本农芸会志，1987，61：457-465.

[9]张正竹，施兆鹏，宛晓春.萜类物质和茶叶香气[J].安徽农业大学学报，2000，27（1）：51-54.

[10]毛义华，郭祥洲，朱名宝，等.一种1，2，3-三甲氧基苯的合成工艺[P].中国：1706783A，2005.

[11]徐克勋.精细有机化工原料及中间体手册仁[M].第一版.北京：化学工业出版社，1998.

[12]张春花.不同有益菌固态发酵对普洱茶香气成分的影响研究[J].茶叶科学，2010，30（4）：251-258.

Analysis of lerpenes and methoxybenzene components in aroma composition of pu-erh raw tea and ripe tea

CAO Yan-ni，LIU Tong-xun
（College of Light and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

Ten kinds of pu-erh tea samples which had different storage time were investigated，the simultaneous distillation and extraction method（SDE）and gas chromatography-masss pectrometry（GC-MS）were used to determine the volatiles in pu-erh tea.Results indicated that the terpenes and methoxybenzene compounds were the main aroma components in puer teas.Monoterpenoids and its oxygenated derivatives were the main terpenes compounds，it also comclude sesquiterpenes and its oxygenated derivatives，oxidation degradation products of carotenoids and ionon.1，2，3-trimethoxybenzene，5-methyl-1，2，3-trimethoxybenzene were the main methoxybenzene components.

pu-erh tea；lerpenes；methoxybenzene；storage time；aroma components

TS272.4

A

1002-0306（2012）05-0128-04

2011－04－15

曹艳妮（1986-），女，硕士研究生，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程。