张淑蓉，武 瑜，梁叶星，钟 耕，2，*

（1.西南大学食品科学学院，重庆400716；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆400715）

南瓜籽仁蛋白多肽的酶法制备和抗氧化活性研究

张淑蓉1，武 瑜1，梁叶星1，钟 耕1，2，*

（1.西南大学食品科学学院，重庆400716；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆400715）

以酸溶性氮得率为评价指标，用木瓜蛋白酶制备南瓜籽仁蛋白多肽。通过正交实验优化酶解条件，确定其最佳酶解工艺为：底物浓度1%、加酶量4%、酶解温度60℃、酶解时间4h，经验证实验所得南瓜籽多肽酶解液的酸溶性氮得率为43.52%±0.39%，其多肽的抗氧化活性可达到VC的20%以上。

南瓜籽粕，酶解，多肽，抗氧化

南瓜籽仁含有多种氨基酸、维生素、矿物质、多糖类等营养成分，以及南瓜籽碱、腺嘌呤、葫芦巴碱等生物碱[1]。研究证实，南瓜籽油中含有一种男性荷尔蒙活性生物触媒剂成分，能消除前列腺的初期肿胀，对泌尿系统及前列腺增生有良好的治疗及预防作用[2-3]。南瓜籽仁的蛋白质含量高达30%～40%，脱脂南瓜籽仁粕的蛋白含量可达50%以上，所含必需氨基酸比例与人体所需氨基酸组成模式相似，可提供维持人类生长所需要的氨基酸和能量，是一种优质的植物蛋白资源[4]。研究表明，南瓜籽蛋白不仅具有降血糖和抗氧化作用[5]，而且对多种肿瘤细胞具有抑制增殖、诱导凋亡和诱导分化作用[6]。近年来我国对南瓜籽的加工利用主要集中在其油脂上，对南瓜籽蛋白方面的研究与发达国家相比较少。目前大多数南瓜籽仁粕一般只被当作工业废料处理，或用做普通饲料的添加物，造成优质蛋白资源的浪费。生物活性肽在人体生长发育、新陈代谢过程中起着关键作用，已成为当今研究热点。大豆多肽、玉米多肽、荞麦多肽、小麦多肽和花生多肽等多种植物多肽的制备工艺已有相关报道[7]，但对南瓜籽仁粕蛋白多肽的研究相对较少。本文用酶法将南瓜籽仁粕中的蛋白降解，并进一步将其多肽的抗氧化活性与VC的抗氧化活性进行研究比较，不仅可以解决南瓜籽仁饼粕蛋白的综合利用问题，也可以为南瓜籽饼粕蛋白的产品开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南瓜籽 产自云南省文山州砚山县（无壳南瓜籽中粗蛋白含量可达34.70%±0.38%，粗脂肪含量44.11% ±1.03%，水分含量7.50%±0.06%）；木瓜蛋白酶 酶活力50万U/g，上海如吉生物科技发展有限公司。

LG-06A型粉碎机 瑞安市百信药机器械厂；HH-4型数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；TGL-16G型台式离心机 上海安亭科学仪器厂；Kjelflex K-360型半自动凯氏定氮仪 瑞士Buchi；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；Spectrum Lab 22pc型可见分光光度计 Leuqquang公司等；PHS－3C型pH计 上海盛磁仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脱脂南瓜籽仁粕粉的制备 将南瓜籽去皮得仁，粉碎后过80目筛，得南瓜籽仁粉。称取20g南瓜籽仁粉于滤纸筒中，索氏抽提4h，回收石油醚，滤纸筒内残留物即为南瓜籽仁粕，经真空加热（55℃）脱溶，过100目筛，获得脱脂南瓜籽仁粕粉，密封置于阴凉处备用。经测定，南瓜籽仁粕中蛋白质含量可达53.94%±0.40%，相当于去壳南瓜籽仁中蛋白质含量为34.70%±0.38%。

1.2.2 蛋白质含量的测定 参照GB/T 5009.5－2003。

1.2.3 酸溶性氮得率的测定[8]脱脂南瓜籽仁粕粉在一定条件下酶解，过滤取上清液，调节上清液pH至4.5，使水溶性蛋白等电沉淀，离心（5000r/min）10min，取上清液，用凯氏定氮法测得上清液中可溶性氮则视为酸溶性氮，经下式计算可得酸溶性氮得率：

1.2.4 南瓜籽仁蛋白多肽的制备工艺流程 南瓜籽仁粕粉→调底物浓度→调温→调pH→酶解→灭酶→过滤→沉淀蛋白→离心→活性炭脱苦、脱色→浓缩[9]

准确称取南瓜籽仁粕粉，加适量纯水配制成一定质量浓度的南瓜籽仁粕悬浊液，调节恒温水浴锅中温度至反应温度，调pH至7.0[10]，加入一定比例的木瓜蛋白酶，搅拌，恒温酶解，并不断搅拌，同时滴加0.1mol/L的NaOH以保持体系pH恒定。达到反应预定时间后，将南瓜籽仁粕蛋白酶解液迅速放入100℃水浴中，保温5min使酶活力丧失，抽滤得滤液，用0.1mol/L HCl调节上清液pH至4.5，使水溶性蛋白等电沉淀，离心后取上清液，用活性炭（1∶10）进行脱苦、脱色处理后[11]，离心去活性炭，取上清液在旋转真空泵中浓缩得产物。

1.2.5 酶解单因素实验及优化酶解条件的正交实验

1.2.5.1 底物浓度对酸溶性氮得率的影响 配制底物蛋白浓度为0.5%、1%、2%、3%的悬浊液，并依次加入5%木瓜蛋白酶（以蛋白浓度计算），使酶均匀分散于水中后加入到南瓜籽仁粕粉悬浊液中，置于55℃恒温水浴锅中水解2h，过滤后取上清液。用0.1mol/L HCl调节pH至4.5，使水溶性蛋白等电沉淀，离心后取上清液，测酸溶性氮得率。

1.2.5.2 加酶量对酸溶性氮得率的影响 取相当于蛋白浓度1%的南瓜籽仁粕悬浊液，分别加入3%、4%、5%、6%的木瓜蛋白酶，于55℃恒温水浴锅中水解2h，过滤得滤液，等电点沉淀蛋白后离心，测上清液中酸溶性氮得率。

1.2.5.3 温度对酸溶性氮得率的影响 取相当于蛋白浓度1%的南瓜籽仁粕粉悬浊液，加酶量4%，分别置于50、55、60、65℃恒温水浴锅中水解2h，过滤得滤液，等电沉淀蛋白后离心，测上清液中酸溶性氮得率。

1.2.5.4 时间对酸溶性氮得率的影响 取相当于蛋白浓度1%的南瓜籽仁粕粉悬浊液，加酶量4%，置于55℃水浴锅中分别水解2、3、4、5、6h，过滤得滤液，等电点沉淀蛋白后离心，测上清液中酸溶性氮得率。

1.2.5.5 南瓜籽粕酶解的正交实验设计 为了优化南瓜籽仁粕酶解的反应条件，在单因素实验初步确定的酶解条件的基础上，以酸溶性氮得率为评判指标，选择底物浓度、加酶量、酶解温度和酶解时间为因素进行正交实验，因素水平见表1。

表1 优化酶解L9（34）正交因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment on enzymatic hydrolysis

1.2.6 优化条件下所得水解液中固形物含量的测定

水解后滤液经蛋白等电点沉淀，离心所得上清液中可溶性氮可视为肽氮[12]，所含固形物可视为南瓜籽仁多肽和氨基酸。

准确称取10g南瓜籽仁粕粉，依正交实验所得的优化工艺进行水解，水解液于5000r/min离心10min，取上清液，50℃下用活性炭搅拌处理30min后，同样条件下离心去活性炭，上清液于旋转蒸发器中浓缩，转入容量瓶中，定容至100mL[13]。

称取25g先后用6mol/L浓盐酸和蒸馏水冲洗、干燥后的石英砂于平底皿中，连同皿盖、玻璃棒置于105℃烘箱中干燥至恒重，称重m0。加入10mL肽液于平底皿中，连同皿盖、玻璃棒称重m1。用玻璃棒将肽液与石英砂混匀，连同皿盖、玻璃棒一起放入105℃烘箱中烘至恒重后，称重m2[14]。

1.2.7 南瓜籽仁蛋白多肽抗氧化性质的研究 以正交实验设计所获得的最优工艺参数，制备南瓜籽仁粕蛋白酶解液。参照He Yenhun等[15]的方法，取1mL浓度各为0.1、0.5、1、5、20mg/mL的样品液，分别加入2.5mL质量分数为1%的铁氰化钾溶液和2.5mL的磷酸盐缓冲液（pH6.6，0.2mol/L），混匀后在50℃水浴20min，然后加入2.5mL10%的三氯乙酸，混匀后以3000r/min离心10min，取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1%的FeCl3，混匀后在700nm波长下比色，以去离子水作为空白，记录吸光度值。以VC作为对照，吸光度值越大则样品的抗氧化能力越强[5]。

2 结果与分析

2.1 底物浓度对酸溶性氮得率的影响

底物浓度对酸溶性氮得率的影响结果见图1。

由图1可知，在底物浓度较低时，酸溶性氮得率随底物浓度的增加而提高；当底物浓度超过1%后，酸溶性氮得率趋于平衡而略有下降。当底物浓度为1%时，酸溶性氮得率显著高于底物浓度为0.5%、3%时的酸溶性氮得率（P＜0.05）；与底物浓度为2%时差异不显著（P＞0.05）。因此，初步将反应底物浓度定为1%。

2.2 加酶量对酸溶性氮得率的影响

加酶量对酸溶性氮得率的影响结果见图2。

由图2可知，在其它因素固定不变的条件下，南瓜籽仁粕蛋白酶解液中的酸溶性氮得率随着酶用量的增大而升高。酶用量在4%以下时，酸溶性氮含量增长显著（P＜0.05），酶用量为4%以上时，酸溶性氮得率含量增长缓慢（P＞0.05）。据翟瑞文等[16]的报道，酶量过高时，由于酶本身的相互水解作用加强，会阻碍酶对底物的水解。另外从生产成本考虑，加酶量初步定于4%。

图1 底物浓度对酸溶性氮得率的影响Fig.1 Effect of substrate concentration on yield of acid soluble nitrogen

图2 加酶量对酸溶性氮得率的影响Fig.2 Effect of enzyme concentration on yield of acid soluble nitrogen

2.3 温度对酸溶性氮得率的影响

温度对酸溶性氮得率的影响结果见图3。

图3 温度对酸溶性氮得率的影响Fig.3 Effect of temperature on yield of acid soluble nitrogen

如图3所示，温度从45℃上升到55℃，南瓜籽蛋白酶解液中酸溶性氮得率呈显著上升趋势（P＜0.05），但当温度从55℃上升到60℃时，酸溶性氮得率增长不显著（P＞0.05）；继续升温，酸溶性氮得率显著下降（P＜0.05）。因此，初步确定水解温度为55℃。

2.4 时间对酸溶性氮得率的影响

时间对酸溶性氮得率的影响结果见图4。

如图4所示，在其它因素固定不变的条件下，南瓜籽仁粕粉酶解液中的酸溶性氮得率随着酶解时间的增加而升高。水解时间小于4h时，酸溶性氮得率增长趋势较明显（P＜0.05），当水解时间大于4h时，酸溶性氮得率增长不显著（P＞0.05）。分析其原因可能为酶解一定时间后，水解液中底物浓度、酶浓度等都发生一定的变化，使反应条件逐渐脱离最佳酶解条件，造成酶解程度上升缓慢。此种情况可以通过监控反应过程中pH的变化，采用滴加酸碱液来保持反应体系pH的恒定。为防止反应体系的过度水解，结合生产成本考虑，综合各因素确定水解时间为5h。

图4 时间对酸溶性氮得率的影响Fig.4 Effect of time of enzymatic hydrolysis on yield of acid soluble nitrogen

2.5 南瓜籽仁粕酶解的工艺参数

以底物浓度、加酶量、反应温度和反应时间为实验因素，以酸溶性氮得率为指标，对南瓜籽仁粕粉酶解参数作正交优化实验，实验设计和结果见表2。

表2 优化酶解条件L9（34）正交实验结果Table 2 Results of orthogonal experiment on enzymatic hydrolysis conditions

表3 正交实验方差分析表Table 3 The analysis of variance

由正交实验结果（表2）及方差分析（表3）可知，南瓜籽仁粕酶解的影响因素主次顺序为B＞A＞C＞D，其中加酶量具有显著影响，其它因素影响不显著。直观分析得出较优组合为A2B2C3D1。极差分析得出较优组合为A3B2C3D3，故进行三次重复实验，重复实验结果表明组合A2B2C3D1所得酸溶性氮得率（43.53%）高于组合A3B2C3D3所得酸溶性氮得率（42.23%），因此确定酶解最佳条件组合为A2B2C3D1，即：底物浓度1%，加酶量4%，酶解温度60℃，酶解时间为4h。经验证实验获得的酸溶性氮得率为43.52%±0.39%。

2.6 南瓜籽仁蛋白多肽的抗氧化还原能力的测定

所得浓缩南瓜籽仁蛋白水解液中固形物（肽和氨基酸）含量可达（57.97±0.21）mg/mL。

在还原能力测定实验中，来自样品中的抗氧化剂能将铁氰化钾中的Fe3+还原成Fe2+，Fe2+进一步生成在700nm处有最大吸光值的Perl普鲁士兰，因此测定700nm处吸光值的高低可以间接反映抗氧化剂还原能力的大小[17]。将不同浓度南瓜籽仁多肽的吸光度与相应浓度VC的吸光度进行比较，可得出南瓜籽多肽的抗氧化能力，实验结果见图5。

图5 南瓜籽多肽的抗氧化能力Fig.5 Antioxidant activity of pumpkin seed peptide

从图5可以看出，不同浓度的VC与南瓜籽仁多肽都有一定的吸光度。一般情况下，样品的还原能力与抗氧化能力呈正相关[18]，说明不同浓度的VC与南瓜籽仁多肽都有一定抗氧化活性。如图5所示，南瓜籽仁多肽样品在低浓度下吸光值比较小，说明还原能力比较差，5.00～20.00mg/mL浓度范围内，随着浓度增加，南瓜籽仁多肽的还原能力有较好的量效关系。而VC的在浓度达到1mg/mL之前，抗氧化能力随浓度的增大而增强；浓度达到1mg/mL之后，其抗氧化能力则有缓慢下降的趋势，说明VC在适宜的浓度范围内有较好的还原能力，并非浓度越高还原能力越好，与朱艳华[19]的研究结果一致。在实验剂量范围内，南瓜籽仁多肽的抗氧化能力比VC低，当浓度达到20mg/mL时，南瓜籽仁多肽的抗氧化能力是VC的20.98%。

3 结论

3.1 实验得出，用木瓜蛋白酶酶解脱脂南瓜籽仁粕制备南瓜籽仁多肽的优化工艺条件为：蛋白底物浓度为1%，加酶量4%，酶解温度60℃，酶解时间4h。加酶量为反应显著影响因素。在最优条件下所得浓缩南瓜籽仁蛋白水解液中固形物（肽和氨基酸）含量可达（57.97±0.21）mg/mL，酸溶性氮得率达43.52%±0.39%。

3.2 以VC作对照，南瓜籽仁多肽与VC相比有一定的抗氧化活性，但抗氧化活性较VC差。在实验浓度范围内，随着南瓜籽仁多肽浓度的增加，其抗氧化能力增强；在浓度加至20mg/mL时，南瓜籽仁多肽还原能力是VC的20.98%，并有继续上升的趋势。

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Preparation of pumpkin seed peptide by enzymatic hydrolysis and its antioxidative activity

ZHANG Shu-rong1，WU Yu1，LIANG Ye-xing1，ZHONG Geng1，2，*
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400716，China；2.Engineering Technique Research Center of Chongqing for Special Food，Chongqing 400715，China）

The preparation of pumpkin seed peptide with enzyamtic hydrolysis was studied，acid soluble nitrogen was used as a evaluating target.The optimal conditions of the process were obtained by orthogonal experiment as follows：substrate concentration 1%，enzyme dosage 4%，incubate temperature 60℃，and time 4h.Under these conditions，experiment validates that acid soluble nitrogen yield was 43.52%±0.39%.And the antioxidative activity of the peptide was more than 20%of that of VC.

pumpkin seed meal；enzymatic hydrolysis；peptides；antioxidative activity

TS255.1

B

1002-0306（2012）03-0241-04

2011－02－11 *通讯联系人

张淑蓉（1985-），女，硕士研究生，研究方向：粮食、油脂工程。

重庆市高校优秀科技成果转化项目（KJZH08221）。