程露露，傅金辰，杨丹丹，张含薇，俞姗杉，陈 敏

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

一株嗜盐古菌DSFD111的分类学鉴定

程露露，傅金辰，杨丹丹，张含薇，俞姗杉，陈 敏

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

采用形态学和系统发育分析对一株嗜盐古菌DSFD111进行了分类学鉴定.分离到的DSFD111菌株为革兰氏阴性球菌，不产芽胞，细胞内含类脂粒.最适生长温度为37 ℃， 最适pH为7， 最适生长NaCl浓度为4.3 mol/L，表明该菌株属于极端嗜盐菌.根据16S rRNA基因序列的系统发育分析，DSFD111菌株归于盐盒菌属(Haloarcula)，与最近缘的Haloarculaargentinensis的相似度为99%.

嗜盐古菌；菌种鉴定；16S rRNA

嗜盐菌(Halophiles)是指生长需要盐且在一定盐浓度的环境中生长最佳的微生物[1].长期的选择压力使嗜盐菌形成了对环境胁迫的适应机制，能够产生多种嗜(耐)盐功能酶及其他特殊性质的活性物质[2]，成为一类新型的、极具应用前景和开发潜力的极端微生物资源.

我国的云南、新疆和内蒙古等地区存在着数量众多的盐湖或盐碱湖，对这类自然高盐环境中的嗜盐微生物已有较多的研究[3-6].而我国东部沿海地区拥有众多的盐田、盐场，是典型的人工高盐环境，对此类环境中的包括中度嗜盐菌在内的微生物的研究相对还较少[7-9].岱山是浙江省最大的产盐县，岛上有数万亩盐田，为研究盐田环境嗜盐菌资源提供了极好的条件.2010年，本实验室从岱山盐场采集土壤及卤水样品，利用选择性培养基共分离得到181株嗜盐菌菌株，其中DSFD111菌株经检测具有较高的淀粉酶和脂肪酶活性(结果已另文报道)，本研究主要对DSFD111菌株进行分类学鉴定和系统发育分析，为进一步的开发应用提供理论基础.

1 材料和方法

1.1 菌株

DSFD111菌株：分离自岱山盐场卤水样品，本实验室保存.

1.2 培养基

嗜盐菌RM培养基：MgSO4·7H2O,20.0 g·L-1;柠檬酸钠,3.0 g·L-1;KCl,2.0 g·L-1;无水CaCl2,0.2 g·L-1;细菌蛋白胨(L 37),10.0 g·L-1;NaCl,250 g·L-1;琼脂,15.0 g·L-1;pH 7.0.

1.3 形态学鉴定

1.3.1 菌落形态：取试管斜面保藏的菌种在25% NaCl的RM固体平板培养基上划线，保鲜膜包覆，倒置在37 ℃光照培养箱中培养1周，观察平板上单菌落的颜色、大小、形状、边缘、表面突起及透明程度等.

1.3.2 菌体形态[10]：载玻片上滴1滴已灭菌的25% NaCl溶液，从平板上挑取新鲜培养的菌种，涂片风干后，以2% 的冰乙酸覆盖5 min固定脱盐，洗去多余的乙酸并晾干；用结晶紫覆盖1～2 min进行简单染色，蒸馏水洗去染液，晾干，普通光学显微镜观察细胞的形状，并测定其大小.

1.3.3 革兰氏染色：涂片方法同上.革兰氏染色用结晶紫初染90 s，水洗，滴加卢戈氏(Lugol’s)碘液冲去残水，覆盖1 min，水洗，95%的乙醇滴洗，直至流出的液体不呈紫色，约20～30 s，立即水洗，0.5%番红水溶液复染1～2 min，水洗，晾干后镜检.

1.3.4 芽孢染色：采用改良Schaeffer-Fulton染色法，取1～2滴无菌盐水于小试管中，用接种环挑取培养2周的菌体于该试管中，充分打散混匀，制成浓稠的菌悬液.加2～3滴5% 的孔雀绿染液于小试管中，轻轻摇晃，使染液与菌液充分混合.将小试管用沸水浴加热15～20 min.用接种环从试管底部挑取几环菌液于洁净的载玻片上，制成涂片，通过酒精灯火焰2～3次固定，晾干.水洗至流出的水无绿色止.加0.5% 番红水溶液复染 5 min，倾去染液，用吸水纸吸干.油镜下观察.

1.3.5 类脂粒(PHB)颗粒检测[11]：按1.3.2的方法制备涂片.苏丹黑染液染10 min，用水冲去染剂，再用二甲苯冲洗涂片至无色素洗脱.用0.5%番红复染1～2 min，水洗，干燥，镜检.类脂粒染成蓝黑色，菌体其他部分呈红色.

1.4 系统发育分析

1.4.1 菌体DNA的提取[12]：纯化后的单菌落接种至相应NaCl浓度的液体培养基中，37 ℃，180 r/min恒温光照摇床培养过夜.取1 mL培养好的菌悬液至1.5 mL离心管中，10 000 r/min高速离心5 min，弃去上清液，加无菌水1 mL冲洗，充分旋涡后离心去上清液，重复2次.加双蒸水100 μL，旋涡震荡器充分震荡悬浮，加保鲜膜封口，于沸水浴中煮沸10 min，取出后立即置于冰中.瞬时高速离心，直接取2 μL上清液作为PCR反应模板.

1.4.2 16S rRNA 扩增：采用古菌通用引物[13]22：5′-ATTCCGGTTGATCCTGC-3′和1540R：5 ′-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3′， PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min.1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，稳定电压90 V，电泳25 min.

图1 菌株DSFD111菌落形态Fig. 1 The colony morphology of strain DSFD111

1.4.3 系统发育树的构建及分析：PCR产物送上海桑尼生物公司进行序列测定.测序结果提交到GenBank得到基因序列登录号，并通过EzTaxon server 2.1寻找相似性较接近的几个模式菌株的16S rRNA序列，利用MEGA5.0 软件构建系统发育进化树.

1.5 生理生化鉴定

依据文献[11,14]中相关内容进行.

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

将菌株DSFD111于RM平板培养基上划线培养1周后观察，菌落呈红色、圆形、直径约3 mm、表面光滑、边缘整齐、中间有突起(如图1).在光学显微镜下观察菌体形态，呈球状，直径约1.5 μm.革兰氏染色阴性，不产芽胞，细胞内含类脂粒.

2.2 系统发育分析

扩增菌株DSFD111的16S rRNA基因序列，将PCR产物进行序列测定，测序结果提交至 GenBank得到基因序列登录号为JQ068948.查找与该菌株亲缘关系较近的已发表的10个模式菌株的16S rRNA序列，采用MEGA 5.0软件包中的Kimura 2-Parameter model及Neighbor-Joining法进行聚类分析和构建系统发育进化树，结果如图2所示.

图2 菌株DSFD111 及其近缘种构建的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree showing the relationship between DSFD111 and the type species in Haloarcula

结果表明，菌株DSFD111与Haloarcula属中的Haloarculaquadrata801030/1T，HaloarculavallismortisCGMCC1.2048T，HaloarculaargentinensisJCM9737T，HaloarculaamylolyticaBD-3T以及HaloarculajaponicaJCM7785T聚为一支，说明与它们都有较近的亲缘关系，其中与最近缘的HaloarculaargentinensisJCM9737T的相似度为99%.因此，分子鉴定结果DSFD111归于Haloarcula属.

2.3 生理生化特征

根据分子鉴定结果，选择模式菌株HaloarculaargentinensisJCM9737[15]为参照菌株，进行了部分的生理生化试验，结果见表1.

表1菌株DSFD111的生理生化特性
Tab.1PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofstrainDSFD111

特性HaloarculaargentinensisJCM9737TDSFD111最适生长NaCl浓度/(mol/L)2.5～3.04.3最适生长温度/℃4037最适生长pHNR7.0革兰氏染色--运动性++过氧化氢酶++H2S形成NR-硝酸盐还原NR+甲基红试验NR+伏-普试验NR+明胶水解++淀粉水解++酪素水解NR-吐温80++糖发酵 葡萄糖++ 果 糖NR+ 麦芽糖++ 蔗 糖++ 木 糖NR- 甘露醇-- 甘露糖++ 半乳糖++ 山梨醇-- 核 糖++ α-乳糖--

+：阳性；-：阴性； NR：未见报道.

以上结果表明，DSFD111菌株的主要生理生化特征与Haloarculaargentinensis标准菌株基本吻合.综合上述形态、生理生化特性以及16S rRNA基因测序结果，初步鉴定DSFD111菌株为Haloarculaargentinensis.

3 讨 论

嗜盐古菌一般栖居在海水、日光晒盐池、天然盐湖或人工腌制食品的表面，在接近饱和的高盐环境中，属优势种群.由于早期的分类鉴定多侧重于形态和生理生化特性，嗜盐古生菌的分类地位一直倍受争议.直到20世纪70年代末三域学说(Three domains)[16]的提出，把微生物划分为细菌域(Bacteria)、古菌域(Archaea)、真核生物域(Eukarya)3个分类单元，并从细胞结构、遗传机制等方面与细菌域和真核生物域相比较，发现古生菌确实与真细菌和真核生物存在很大不同[17]，同时在方法上建立了以16S rRNA基因为指征的序列分析技术，大大推进了古生菌菌种鉴定的相关研究.

嗜盐古菌的分类地位归属于古菌域(Archaea)、广古菌门(Euryarchaeota)、盐杆菌纲(Halobacteria)、盐杆菌目(Halobacteriales)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)，目前仅此一科.1957年，Elazari-Volcani提出了盐杆菌科的第一个属，即盐杆菌属(Halobacterium)[18].随后，Gibbons于1974年确立了盐球菌属(Halococcus)，是盐杆菌科的第二个属[19].2001年，伯杰氏系统细菌学手册依据16S rRNA基因序列分析结果、极性脂的组分、细胞形态及一些其它的表型特征，将盐杆菌科划分为15个属[20].到2009年，该科已包含27个属，96个正式发表的种[21].

本研究对嗜盐古生菌DSFD111进行了16S rRNA序列同源性分析.扩增结果与GeneBank上的标准序列进行比对，结果显示，DSFD111菌株与Haloarculaargentinensis标准序列比较同源性在99%以上.进一步的生理生化鉴定结果表明，其主要特征与Haloarculaargentinensis标准菌株基本吻合.因此，初步鉴定DSFD111菌株为Haloarculaargentinensis，是一株极端嗜盐古生菌.

[1] 刘志恒.现代微生物学[M].北京:科学出版社,2008:196-201.

[2] Chen Lei, Wang Guangyu, Bu Tong,etal. Phylogenetic analysis and screening of antimicrobial and cytotoxic activities of moderately halophilic bacteria isolated from the Weihai Solar Saltern (China)[J]. World J Microb Biot, 2010, 26(5):879-888.

[3] 迪丽拜尔·托乎提,旭格拉,穆尔特扎,等.新疆罗布泊周边地区极端环境嗜盐菌的研究[J].生物技术,2009,19(5):16-19.

[4] 柴丽红,王涛,崔晓龙,等.青海柯柯盐湖16株细菌的ARDRA筛选及系统发育初步分析[J].云南大学学报：自然科学版,2003,25(6):541-544.

[5] 孟凡旭,吴敏,张会斌,等.阿牙克库木湖嗜盐菌的分离及功能酶的筛选[J].浙江大学学报：理学版,2006,33(6):671-675.

[6] 潘海莲,周成,王红蕾,等.内蒙古锡林浩特地区嗜盐古菌多样性的研究[J].微生物学报,2006,46(1):1-6.

[7] 田新玉,刘洪灿,郭金昌.青岛东风盐场中极端嗜盐古细菌的特性[J].应用与环境生物学报,1998,4(2):175-178.

[8] 周旭华,王勇,吴敏.舟山地区嗜盐菌的分离和产胞外多糖菌株的筛选[J].浙江大学学报：理学版,2007,34(3):335-339.

[9] 何敏艳,邹正中,蔡林,等.连云港台北和盐城三圩盐田土壤嗜盐菌多样性研究[J].微生物学通报,2008,35(5):737-742.

[10] Dussault H P. An improved technique for staining red halophilic bacteria[J]. J Bacteriol, 1955, 70(4):484-485.

[11] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001：349-370.

[12] 陈敏,赵立平.焦化废水处理系统中不同培养基分离的细菌种群多样性[J].微生物学报,2003,43(3):366-371.

[13] 张萌,张晓梅,窦文芳,等.嗜盐脂肪酶产生菌的筛选及其粗酶性质[J].微生物学通报,2009,36(1):14-19.

[14] Holt J G, Krieg N R, Sneath P H A,etal. Bergey’s manual of determinative bacteriology[M]. 9th ed. Baltimore: Williams and Wilkins,1994:175-187.

[15] Ihara K, Watanabe S, Tamura T.Haloarculaargentinensissp. nov. andHaloarculamukohataeisp. nov., two new extremely halophilic archaea collected in Argentina[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 1997, 47(1):73-77.

[16] Woese C R, Kandler O, Wheelis M L. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya[J].Proc Natl Acad Sci, 1990, 87(12):4576-4579.

[17] Preseott L M, Harley J P, Klein D A. Microbiology[M]. Boston: McGraw-Hill,2002:442.

[18] Genus XII.Halobacterium[M]//Elazari-Volcani B. Bergey’s manual of determinative bacteriology. 7th ed. Baltimore: Willians and Wilkins,1957:207-212.

[19] Gibbons N E. Family V. Halobacteriaceae fam. nov[M]//Buchanan R E, Gibbons N E. Bergey’s manual of determinative bacteriology. 8th ed. Baltimore: Willians and Wilkins,1974:269-273.

[20] Boone D R, Castenholz R W, Garrity G. Bergey’s manual of systematic bacteriology [M]. New York: Springer-Verlag,2001:1-251.

[21] Oren A, David R A, Ventosa A. Emended descriptions of genera of the familyHalobacteriaceae[J]. Int J Syst Evol Microbiol,2009,59(3):637-642.

IdentificationofaHalophilicArchaeaDSFD111

CHENG Lu-lu, FU Jin-chen, YANG Dan-dan, ZHANG Han-wei, YU Shan-shan, CHEN Min

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

A halophilic archaea DSFD111 was identified based on morphology and phylogenetic analysis. The strain is Gram-negative bacteria, no spores and contains lipid particles. The best growth environment of the strain is 37 ℃, pH 7 and 4.3 mol/L NaCl, which indicates that the strain is extreme halophiles. The phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene homology shows that the strain belongs toHaloarcula, and shares 99% similarity withHaloarculaargentinensis.

halophilic archaea; strain identification; 16S rRNA

2012-07-03

杭州市科技发展计划项目(20101032B26).

陈 敏(1963—)，女，教授，主要从事微生物研究.E-mail:mchen63@163.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2012.06.004

Q93

A

1674-232X(2012)06-0495-05