王 燕，彭莉萍，罗镇明

(遵义医学院珠海校区 生物化学与细胞分子生物学教研室，广东 珠海 519041)

琼脂糖电泳中核酸染料Goldview最佳使用方案的建立

王 燕，彭莉萍，罗镇明

(遵义医学院珠海校区 生物化学与细胞分子生物学教研室，广东 珠海 519041)

目的确定琼脂糖凝胶电泳中使用核酸染料Goldview的最佳浓度和方法，尽可能减少实验中Goldview用量，控制其对实验室环境的污染。方法配置含不同浓度Goldview的上样缓冲液，混合不同浓度 DNA溶液的琼脂糖凝胶电泳，然后对比预染样品法、前染法及后染法的染色效果。结果实验结果显示上样缓冲液中含0.4% Goldview的预染样品法电泳检测核酸的效果最佳且能检测的核酸样品浓度在16.5ng或以上为最佳。结论核酸染料Goldview在核酸的琼脂糖凝胶电泳中使用的最佳方案为预染样品法，实验中推荐浓度达到普通实验要求，并且最易控制对周围环境的污染。

琼脂糖凝胶电泳；核酸染料；Goldview

目前实验室中所用的核酸染料主要有EB(溴化乙啶)、SYBR Green I和Goldview等。作为核酸染料它们对人体都存在一定程度的危害。EB作为一种常规的核酸染料曾广泛的被应用于琼脂糖凝胶[1]和聚丙烯酰胺凝胶[2]中DNA与RNA的观察和检测，但EB是一种诱变剂，可插入核酸相邻碱基平面之间，引起基因突变，具有中等毒性，对人体有潜在的危害性[3]。SYBR Green I是近些年新推出的一种荧光核酸染料，因其危害性较低而逐渐成为EB的替代品之一[4]，但ssDNA的检测灵敏度不高，效果不好，应用于DNA凝胶电泳中稳定性不高。目前琼脂糖凝胶电泳中Goldview已被广泛使用，其染色效果和灵敏度与EB相近，且未证实有致癌性[5]，是EB较理想的替代品。但它穿透能力强，对眼睛和皮肤有明显的刺激性。实验中由于Goldview的用量过大或实验员的不慎，导致桌面、扶手、门锁等多处被污染。实验室中使用Goldview进行染色的方法主要有前染法和后染法[6]，但在以往的实验中曾发现预染样品法信噪比高，条带边缘锐利。因此，本实验旨在探索上样缓冲液中Goldview的最佳浓度值，使其染色效果与前染法和后染法相近，同时又可节省Goldview的用量，降低成本，也可减少Goldview对实验室的污染及对人体的危害，以便在实验室中推广应用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 DYY-2C型电泳仪(北京六一仪器厂)、ZF1-Ⅱ紫外线凝胶成像系统(上海嘉鹏科技有限公司)。

1.2 主要试剂 GoldviewTM核酸染料I(北京庄萌国际生物基因科技有限司)、6×Loading buffer(上海捷瑞生物工程有限公司)、DNA Marker(含6种不同大小的DNA 片段,其大小分别为2 000、1 000、750、500、250和100 bp,加亮带750 bp的DNA 片段浓度是30 ng/μl，其余都是10 ng/μl)(宝生物工程(大连)有限公司)、西班牙琼脂糖(上海生物工程有限公司)、5xTBE电泳缓冲液、质粒pEGFP-C1(上海生工生物工程公司)和RNA(生化教研室保存)。

1.3 方法 实验中用Goldview对核酸染色主要通过3种方法：①前染法，即在配置琼脂糖凝胶中加入Goldview，用量一般为1%的20 mL胶溶液加入15 μl；②后染法，即在水中加人Goldview，一般100 mL加5 μl，再将电泳后的胶块浸泡染色；③预染样品法，将含一定浓度Goldview的上样缓冲液与样品一起混合进行上样，电泳。

1.3.1 前染法对DNA marker的染色 在20 mL 1%的琼脂糖凝胶中加入1 μl Goldview，混匀后倒板；将5.0 μl不同浓度的 DNA Marker分别与5.0 μl上样缓冲液充分混匀(见表1)，上样，在101 V电压下进行电泳20 min，于紫外线凝胶成像系统中进行观察。

1.3.2 后染法对DNA marker的染色 配置20 mL 1%的琼脂糖凝胶,倒板；将5.0 μl不同浓度的 DNA Marker分别与5.0 μl上样缓冲液充分混匀(见表1)，上样，于101V电压下电泳20 min后，将胶块放于20 mL加了1 μl Goldview的水中染色5 min，于紫外线凝胶成像系统中进行观察。

1.3.3 预染样品法中Goldview最佳染色浓度的确定 将5.0 μl DNA Marker分别与5.0 μl 不同浓度(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%)的含Goldview 上样缓冲液充分混匀后,进行1 %琼脂糖凝胶电泳,根据凝胶成像结果,确定Goldview的最佳染色浓度为0.4%。

1.3.4 预染样品法对DNA marker的染色 将5.0 μl含0.4%Goldview的上样缓冲液与5.0 μl 不同浓度的DNA Marker一起混合上样(见表1)，在101V电压下电泳20 min后于紫外线凝胶成像系统中进行观察。

表1 3种方法的上样量

2 结果

2.1 3种染色方法 DNA的检测结果较前染法灵敏度高，但是背景高，信噪比较小(见图1)；使用后染法染色，条带出现了拖尾现象，某些条带边缘比较锐利、清晰(见图2)；使用预染样品法染色，背景低，信噪比相对高，条带边缘锐利，便于显示实验结果(见图3)。将3图进行比较分析。

2.2 RNA和质粒在最佳染色浓度下的检测结果琼脂糖凝胶电泳经常用于核酸的检测，RNA电泳的电泳结果清晰可见28s和18s的rRNA条带及mRNA彗星尾图形(见图4)，染料在对RNA染色中均能够起到区分条带、显示浓度差异和有无降解的鉴定作用。实验中DNA电泳出现了明显的三条带，泳动速率最快的是双链环状DNA、其次是线性的DNA，最慢的是单链开环DNA(见图5)。

注：1，2，3 稀释一倍的DNA；4,5,6稀释两倍的DNA；7，8，9未经稀释的DNA;除了750bp处条带浓度从左往右分别是50ng/条带，75 ng/条带,150 ng/条带,其余条带浓度均为16.5ng/条带，25 ng/条带,50 ng/条带。

3 讨论

Goldview作为一种新型的核酸染料，不仅能染DNA，也可用于染RNA，可以检测10ng以上的核酸[7]，以其毒性较低，灵敏度高，该染料稳定性也比较好，4℃避光保存即可，价格是这3种染料中最便宜的[8]，在琼脂糖凝胶电泳中逐步得到了广泛应用。

DNA条带的Goldview染色强度随着DNA浓度的增大而增强，但是小片段的DNA出现了明显的拖尾现象，并且是浓度越大现象越明显[9]。结果表明，对于100bp的条带而言，预染样品法拖尾程度明显降低，并且随着浓度降低，条带边缘锐利，而前染法和后染法边缘依然模糊，出现扭曲[10]，无规则；对于小于750 bp条带而言，后染法的拖尾现象非常明显，并且浓度越高拖尾现象越明显，而前染法的条带边缘不规则。

在样品浓度为16.5 ng/条带时，3种方法的电泳条带均可见，电泳灵敏度达到了普通实验室的要求。但是相对于前染法和后染法中Goldview 1μl的用量而言，预染样品法在10 μl上样量的凝胶里，Goldview在上样缓冲液中浓度为0.4%的条件下的总用量最多为0.18 μl(在十一个孔的凝胶里)，就可以节约0.82 μl Goldview，并且预染样品法条带的亮度均达到一定的效果，通过实验可以发现在样品中加入Goldview可以明显的减少其用量，降低污染。

本研究结果对于实验室常规应用的Goldview核酸染料的使用方案提供了科学的理论，尽管前染法对于DNA 条带的灵敏度略高于预染样品法，但是预染样品法已适合于常规的琼脂糖凝胶电泳中核酸分子的检测，是较好的选择。

[1] 黄永莲.琼脂糖凝胶电泳实验技术研究[J].湛江师范学院学报,2009,30(6):83-85.

[2]王霞,王烨,李琳琳,等.琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测肠道菌群基因扩增产物的方法学比较研究[J].新疆医学,2008,38(5):136-138.

[3]蒋玲艳,王林果.核酸染料的应用研究进展[J].玉林师范学院学报,2006,27(3):131-133.

[4]SingerVL-LawlorTE ,Yue S.Comparison of SYBR GreenI nucleic acid gel stain mutsgenieity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsong reverse mutation assay(Amesteat )[J].Mutant Res,1999,439(37):37-47.

[5]蒋玲艳,王林果.两种核酸染料染色效果的比较研究[J].生物技术通报,2006,11(17)：924-926.

[6]曹秀华,王亚婷,李丽,等.琼脂糖凝胶电泳的条件优化——质粒DNA重组片段的限制性内切酶谱鉴定[J].齐齐哈尔医学院学报,2011,32(1):9-11.

[7]张全渡，冉黎，陆长膏,等.四种核酸荧光染料在琼脂糖凝胶中染色特性的比较分析[J].四川解剖学杂志,2007,15(3):29-31.

[8]刘阳,杨淑霞,李敏惠,等.三种染色方式下四种核酸染料的灵敏度比较[J].成都医学院学报,2008,3(1)：20-23.

[9]黄庆,府伟灵,赵渝徽,等.核酸荧光染料在琼脂糖凝胶电泳中的染色特性[J].Chin J Nosoeomiol,2006,ll(16):1316-1318．

[10]刘阳，杨淑霞，赖翼,等.影响琼脂糖凝胶电泳条带扭曲程度的因素[J].生物学杂志，2009，26(2)：70-72.

EstablishmentoftheoptimalschemeofthenucleicaciddyesGoldviewintheagarosegelelectrophoresis

Wangyan,Pengliping,Luozhenming

(Department of Biochemistry and Molecular Biology,the Zhuhai Campus of Zunyi Medical College,Guangdong Zhuhai 519041,China)

ObjectiveTo confirm the optimal concentration and methods of nucleic acid dyes Goldview used in the agarose gel electrophoresis to reduce the amount of Goldview and further control its pollution to the laboratory environment.MethodsDifferent concentrations of Goldview in the loading buffer were prepared and mixed with different concentrations of DNA solution in the agarose gel electrophoresis.The pre-staining,routine nucleic acid staining and staining after electrophoresis were compared.ResultsThe loading buffer containing 0.4% Goldview in the pre-staining method was best,in which the optimal concentration in the nucleic acid samples was 16.5 ng or above.ConclusionThe optimal scheme of the nucleic acid dyes Goldview in agarose gel electrophoresis is the pre-staining method with the recommended concentrations to meet the common experiment requirement and the easiest way to control the pollution to the surrounding environment.

Agarose gel electrophoresis; nucleic acid dye; Goldview

贵州省科技计划项目(NO：黔科合OZ字[2009]02);贵州省科学技术基础项目(NO：黔科合J字[2008]2318)。

Q33

A

1000-2715(2012)04-0276-03

[收稿2012-06-08；修回2012-07-06]

(编辑：谭秀荣)