曾宪成， 张 彤， 李 华， 方天翎， 聂常富， 陈规划△

(1增城市人民医院普通外科，广东增城511300;2中山大学附属第三医院肝移植中心，广东广州510630;3广州医学院第一附属医院肝胆外科，广东广州510120;4郑州大学附属肿瘤医院肝胆外科，河南郑州450003)

人类白细胞抗原G(human leukocyte antigen－G，HLA－G)是一种非经典的HLA－Ib类抗原，参与保护胚胎免受母体淋巴系统的攻击。它最早于1987年被 Geraghty等［1］克隆，1990 年 Kovats等［2］发现它在胎盘绒毛远端的细胞滋养层特异表达。到目前为止已发现HLA－G在人类多种恶性肿瘤中表达，HLA－G与肿瘤免疫逃逸的关系成为关注的焦点。Wang等［3］发现肝癌中表达HLA－G，并且其是影响预后的独立因素，推测HLA－G可能通过抑制NK细胞，促进肝癌复发、转移。我们在前期实验中发现肝癌细胞系中Hep3B细胞表达HLA－G最少，因此，我们选用Hep3B细胞构建HLA－G过表达模型，研究其在体外与NK细胞杀伤作用的关系。

材料和方法

1 材料

Hep3B细胞购自中科院上海细胞生物研究所，采用含10%FBS高糖DMEM培养基在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养，每3～4 d换液，70%～80%融合后0.25%胰蛋白酶消化传代。大肠杆菌DH5α由中山大学附属第三医院中心实验室保存。胎牛血清及DMEM高糖培养基均购自Gibco，dNTPs(Promega)，Taq polymerase(TaKaRa)，Plasmid Maxi Kit(Qiagen)，Xho I、Bam H I、Age I、T4 DNA ligase 和T4 DNA ligase buffer(NEB)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，Opti－MEM(Gibco)，RNAprep pure总 RNA提取试剂盒(北京天根)，快速凝胶回收试剂盒(O-mega)，SYBR® PrimeScriptTMRT－PCR Kit(TaKa-Ra)，小鼠抗人HLA－G单克隆抗体和小鼠抗人GAPDH单克隆抗体(Abcam)，小鼠抗人HLA－ABC单克隆抗体(Biolegend)，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗小鼠抗体(Pierce)。

2 方法

2．1 引物设计和目的基因扩增 根据GenBank HLA－G的编码序列，用Primer Premier 5软件设计包括HLA－G全长的引物，HLA－G上游引物5’－TAATAACTCGAGATATGGTGGTCATGGCA－3’，下游引物5’－TAATAAGGATCCCTAATCTGAGCTCTTCTTCC －3’，扩增片段为1 017 bp，引物由上海英骏公司合成。以含有待扩增序列……