尹良军，罗小辑，黄 伟，陈 亮，胡 宁，何百成，罗进勇，左国伟，He Tongchuan＃，邓忠良△

（重庆医科大学：1.附属第二医院骨科 400010；2.附属第一医院骨科 400046；3.药学院 400060；4.检验系生物化学与分子药理学重点实验室 400060）

肌腱是肌腹两端的索状或膜状致密结缔组织，由形态相似的梭形肌腱细胞和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）构成。肌腱细胞是肌腱组织的基本功能单位，它合成和分泌Ⅰ型胶原（collagenⅠ，ColⅠ）等细胞外基质，维持肌腱组织的新陈代谢。有研究认为，肌腱修复过程即肌腱成纤维细胞增殖、迁移并分泌ECM的过程，该过程中有多种生长因子有序表达并调控肌腱的修复。生长因子是由细胞产生的，能调节自身和其他细胞功能小分子可溶性蛋白质或多肽，通过与受体特异性的结合启动其效应作用。它可以调节细胞的增殖、分化过程并改变细胞产物的合成，从而对创伤后组织愈合的复杂过程进行调控。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）家族是调控骨骼生长发育的一类重要生长因子，也是调控骨和软骨修复和再生的重要因子。近年来，有研究提示，BMP－12、BMP－13、BMP－14在肌腱愈合过程中可能发挥重要作用，但其作用特点和机制尚不够清楚[1－3]。现将本研究大鼠肌腱愈合过程中BMP－12、BMP－13和BMP－14基因表达水平的变化情况报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选择7周龄无特定病原（specific pathogen free，SPF）级SD雄性大鼠56只，体质量（200±25）g，由重庆医科大学实验动物中心提供。生产许可证号：SCXK（渝）20020002，使用许可证号：SCXK（渝）20020001。实验过程中对实验动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准[4]。

1.2 主要试剂和仪器 Trizol（Gibco公司），The Cells－to－cDNAⅡkit（Ambion公司），Takara PCR Amplification Kit（大连Takara公司），SYBR Premix Ex Taq试剂盒（大连Takara公司）。实时荧光定量PCR（real－time quantitative PCR，qRTPCR）引物如下（Invitrogen公司合成）：cyclophilin－A F：5′－CGA GCT CTG AGC ACT GGA GA－3′；cyclophilin－A R：5′－TGG CG TGT AAA GTC ACC ACC－3′；BMP－12F：5′－GCT GGG ACG ACT GGA TCA－3′；BMP－12R：5′－TGA GCA GCG TCT GGA TGA－3′；BMP－13F：5′－AAG CGA CAC GGC AAG AAG－3′；BMP－13R：5′－CGC AGT GAT AGG CCT CGT－3′；BMP－14F：5′－GCT CTG GCC AGG ATG ACA－3′；BMP－14R：5′－ACT GCA GCG AGC CTT GAG－3′。主要仪器包括CO2培养箱（美 国Thermo公 司）、Eppendorf PCR仪、qRT－PCR仪Mx3000P（美国Stratagene公司）。

1.3 跟腱创伤修复模型的建立 将56只SD大鼠均使用麻醉机面罩给氧和异氟醚麻醉成功后，做右后爪的后中线切口，纵行切开腱鞘，辨明跟腱和跖肌腱，在肌肉肌腱移行部和跟骨止点的中点处横行切断跟腱，然后使用单股的6－0 Prolene（普理灵）线做Kessler－Kirchmeyer法缝合跟腱断端。缝合腱鞘及手术切口。腹腔内注射丁丙诺啡（50μg／kg）进行术后的疼痛控制。手术后的大鼠成对饲养，允许进食、饮水和自由移动，每天观察直到处死。

1.4 标本的获取 分别在术后第1、3、5、7、14、21、28天处死大鼠8只。取右侧跟腱作为实验组的标本，左侧跟腱作为对照组的标本。

1.5 BMP－12、BMP－13、BMP－14表达水平的检测 切下肌肉肌腱交界处至肌腱跟骨止点处之间的肌腱部分。剪碎并在液氮中研磨成浆使用Trizol提取总RNA。按照试剂说明书进行，获得的RNA取少量测其浓度和纯度（OD260／OD280＝2.0），其余置－80℃保存待用。按Taqman试剂盒要求，将RNA逆转录成cDNA，qRT－PCR反应体系配制及扩增条件设置参照定量PCR反应试剂盒说明书进行（SYBR Primer Ex Taq kit，TAKARA）。每个样本共重复检测3次，以Cyclophilin－A作内参，由实时荧光定量PCR仪（Mx3000P）自动给出c（t）值和目的基因的相对含量。

1.6 统计学处理 应用SPSS15.0软件进行统计学数据分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

BMP－12、BMP－13和BMP－14基因在实验组的各个时间点都有表达，见图1。而在对照组没有检测到它们的表达。

图1 实验组的跟腱组织基因表达水平变化柱状图

3 讨 论

BMP是一类生长和分化因子家族，属于TGF－β超家族。BMP首先在脱钙骨基质中发现，是一种多效性的形态发生蛋白，具有趋化性、浓度依赖性、促有丝分裂和分化诱导的特性。在结构方面，BMP是以二硫键相连的二聚体，这种结构决定着BMP的生物学活性。目前已有超过15种BMP被克隆并在人和鼠体内表达。BMP主要调控胚胎期肢体形态的发育，在成年动物体内，BMP可在异位诱导骨与软骨形成，调节骨与软骨的排列、分化模式和方向。遗传学研究显示BMP还在除骨之外的其他组织内发挥作用[5－6]。能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织，同时对细胞增殖、分化、凋亡起重要调控作用。

BMP－12、BMP－13、BMP－14是BMP中有同源序列的 一组，又分别称为生长分化因子（growth differentiation factor，GDF）－7、GDF－6、GDF－5。有研究显示，大鼠肌肉内注射GDF－7、GDF－6、GDF－5可诱导 肌腱或者韧带样组织形成[1]。大鼠GDF－5缺失可出现跟腱超微结构、组织构成和生物力学完整性的改变[7]。

Chhabra等[8]研究发现，肌腱损伤的GDF－5缺陷老鼠跟腱愈合延迟1～2周；跟腱细胞中DNA、黏多糖及胶原含量达峰值时间较对照组延迟5～9 d，且峰值明显低于对照组；新生血管形成也较对照组延迟约1周，且损伤修复部位有更多脂肪细胞形成。这提示GDF－5在细胞聚集、迁移、分化、增殖和血管形成中起重要作用，在肌腱愈合的早期起重要作用。Rickert等[9]用腺病毒载体转导GDF－5基因至大鼠跟腱细胞，8周后大鼠跟腱修复较对照组（局部注射生理盐水）明显增厚，同时可见大量新生软骨组织形成。Dines等[10]将大鼠肌腱横断后缝合，然后用含明胶和重组人GDF（recornbinant human GDF，rhGDF）－5涂层的缝线植入肌腱缝合处。3周后观察发现实验组肌腱修复速度增快，肌腱的最大抗拉力和强度明显增强。同时发现围绕缝线有少量软骨形成。Bolt等[11]采用局部注射可表达BMP－14的重组腺病毒促进大鼠损伤跟腱修复，观察2周后发现，BMP－14使创伤跟腱断端间的缝隙减少，出现大量新生肌腱细胞，缝合处拉伸强度较对照组提高70%。组织学检查证实肌腱组织中未出现异位骨和软骨组织形成。Kuroda等[12]在大鼠的股骨缺损处放置BMP－12的质粒，2周后缺损处主要为纤维样肌腱／韧带组织填充，8周后缺损处才出现骨组织的替代。而在大鼠的股骨缺损处放置BMP－2的质粒，修复过程一直以骨组织再生为主。说明BMP－12和BMP－2的生物学效应不同，主要是调控肌腱细胞的发育。Majewski等[13]观察到肌腱愈合时间显著缩短，愈合质量显著改善。BMP－12作用下，肌腱的早期组织再生很明显，导致创伤跟腱的快速修复和生物力学性能的改善。Haddad－Weber等[2]观察到干细胞向肌腱样细胞的分化和细胞外富含胶原的韧带样基质的形成。

上述研究表明，BMP－12、BMP－13、BMP－14具有BMP家族其他成员类似的特性，不仅在特定组织的发育中起重要作用，还能够显著促进特定组织创伤的修复。在本研究中，大鼠跟腱在没有创伤修复反应的情况下没有明显的BMP－12、BMP－13、BMP－14基因表达；而创伤后，BMP－12、BMP－13、BMP－14基因表达水平均显著提高。提示这3种基因均参与肌腱修复反应。BMP－13、BMP－14基因表达主要在创伤后第1～5天显著增高，在创伤后第7天BMP－13、BMP－14基因表达水平显著下降至低水平维持，提示BMP－13、BMP－14基因主要介导肌腱创伤修复的早期反应。创伤后1～3 d为组织的炎症反应期，7～14 d为组织的增生反应期，28 d为组织的塑形期。因此，本研究结果可能进一步提示BMP－13和BMP－14基因主要对肌腱创伤修复过程中的炎症反应起重要作用，也可能对后续一些特定基因的表达起开关作用，而对肌腱的增生和后期塑形作用较小。BMP－12基因表达在创伤后第1～7天显著增高，在第14～28天BMP－12基因进入一个更高表达的平台期。提示BMP－12参与肌腱创伤修复过程中的早期炎症反应，在肌腱细胞的增生和肌腱组织的晚期塑形中更发挥着重要的作用。

在肌腱发育过程中，BMP－12、BMP－13、BMP－14的功能各有不同，但是可能存在一定的互补性。Mikic等[3]在GDF－7缺失大鼠中观察到鼠尾肌腱束的生化成分，如collⅠ、colⅢ、colⅤ等无明显改变，力学强度也无明显变化。qRT－PCR显示GDF－7缺失大鼠的鼠尾肌腱组织中GDF－5基因表达比野生型大鼠提高50%，提示GDF－7基因缺失可以由GDF－5基因表达增高来代偿，两者的功能存在很大程度的代偿性。在GDF－7缺失大鼠的肌腱中GDF－6基因表达也比野生型大鼠增高，但是增高程度没有GDF－5明显[14]。

组织再生是创伤组织修复的重要手段，在肌腱创伤后修复过程中，BMP－12、BMP－13、BMP－14的功能可能也存在一定程度的互补性。在肌腱修复早期三者同时高表达，但是后期以BMP－12基因表达为主，提示BMP－12可能是目前发现的在韧带／肌腱形成、发育和创伤修复中最关键的细胞因子。

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[4]中华人民共和国科技部.关于善待实验动物的指导性意见[EB／OL].（2009－09－03）[2011－09－25].http：／／www.most.gov.cn／fggw／zfwj／zfwj2006／zf06wj／zf06bfw／200609／t20060930＿54196.htm.

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