武变瑛，李利平，张新颖，王艳，巴卫松

（1．河北大学 基础医学院，河北 保定 071000；2．河北大学 中医学院，河北 保定 071000；

3．石家庄市药品检验所 质保科，河北 石家庄 050051；4．定州市人民医院 药剂科，河北 定州 073000）

杏花雨对血管性痴呆大鼠行为及其海马Bcl－2，Bax蛋白表达的影响

武变瑛1，李利平1，张新颖2，王艳3，巴卫松4

（1．河北大学 基础医学院，河北 保定 071000；2．河北大学 中医学院，河北 保定 071000；

3．石家庄市药品检验所 质保科，河北 石家庄 050051；4．定州市人民医院 药剂科，河北 定州 073000）

为研究杏花雨对血管性痴呆大鼠行为学及大鼠海马Bcl－2，Bax蛋白表达的影响，采用反复缺血再灌注＋硝普钠方法复制出血管性痴呆（VD）动物模型，并观察银杏黄酮注射制剂杏花雨对VD大鼠的保护作用，采用Morris水迷宫检测其行为学，免疫组织化学法检测并观察其海马Bcl－2，Bax蛋白表达．研究结果显示：与假手术组相比，模型组大鼠Bcl－2，Bax蛋白表达增加（P＜0．01），Bcl－2／Bax（阳性细胞数比值）显著降低，经杏花雨a，b及金纳多治疗后，与模型组相比，VD大鼠认知能力显著改善（P＜0．01），海马CA1区Bcl－2阳性细胞数均有提高（P＜0．05），杏花雨b组有明显提高（P＜0．01）；大鼠海马CA1区Bax阳性细胞数降低，尤其以杏花雨b组降低明显（P＜0．01），Bax／Bcl－2也较假手术组与模型组明显提高（P＜0．05）．结果表明杏花雨可以改善血管性痴呆大鼠的认知能力，推测与Bcl－2，Bax蛋白表达有关．

血管性痴呆；杏花雨；银杏黄酮；行为学；Bcl－2；Bax

银杏叶是一种用途极为广泛、不良反应极少的天然药物．中国用其入药已有上千年历史，银杏叶现代药用开发始于20世纪60年代，其提取物（EGb）含银杏萜内脂、银杏黄酮等成分［1］，其中银杏黄酮具有多种生理活性，除对心血管具有明显的保护作用外，在神经系统中也有明显疗效，如保护神经细胞免受损伤，改善神经退行性改变和衰老，提高学习记忆功能等［2］．目前中国采用的EGb大多为口服制剂，针剂少见，进口注射制剂如德国产“金纳多”由于价格昂贵不能普遍应用于基层．杏花雨注射液为河北医科大学药理教研室新研制的EGb注射剂，本研究采用的高纯度银杏黄酮注射制剂（杏花雨）采用特殊工艺分离银杏叶提取物，使其有效成分银杏黄酮甙的含量高达55%，高于国际通用标准1倍以上．根据黄酮甙含量不同分为杏花雨a及杏花雨b，银杏叶提取物国际标准是黄酮甙≥24%，“金纳多”刚符合国际标准，而杏花雨b黄酮甙的含量高达55%，杏花雨a这一指标与金纳多持平，为24%，杏花雨注射液成本低廉．本文将通过实验证实杏花雨有效成分的高低是否决定着产品的优劣．近年来随着人口老龄化日趋明显，血管性痴呆（vascular dementia，VD）的发病逐年增加，成为老年性痴呆的主要类型之一，该病具有潜在的可预防性，被称为“可逆性痴呆”，因此探讨VD的更加有效治疗方法有重要的医学价值．本实验采用缺血再灌注法复制VD大鼠模型，用杏花雨注射液进行治疗，金纳多做为阳性对照药，观察银杏黄酮的疗效及作用机制．

1 材料和方法

1．1 动物

健康成年雄性Wistar大鼠72只，普通级，体重220～250 g，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证编号：1103188．

1．2 主要药物

杏花雨注射液由河北医科大学药理教研室提供，规格5 m L／支，分为杏花雨a，b 2种，其中杏花雨a黄酮甙含量为4 mg，杏花雨b黄酮甙含量为6．5 mg；金纳多针剂由德国威玛舒培博士药厂出产（批号E8166），规格5 m L／支，内含黄酮甙4．2 mg．

1．3 试剂与仪器

Bcl－2一抗、兔超敏二步法免疫组化检测试剂、DAB试剂盒，北京中杉金桥生物有限公司；MT＿200 Morris水迷宫视频跟踪分析系统，成都泰盟科技有限公司；NIKON TS100倒置显微镜及Mias2000图像分析系统，NIKON公司．

1．4 模型复制

采用双侧颈动脉缺血再灌注＋硝普钠降压法［3］制作VD模型，此法是先暴露大鼠双侧颈总动脉，穿线备用，先腹腔注射硝普钠（3．5 mg／kg）造成低血压，再用无创动脉夹加闭3次，每次10 min，再通10 min，最后1次再通30 min后缝合伤口，缝合前伤口处撒敷青霉素粉末，术后注意保温与苏醒老鼠的水分补充．假手术组只分离颈总动脉，不进行缺血再灌注手术．模型复制成功后除假手术组外，其余大鼠分别分为模型组、杏花雨a组、杏花雨b组、金纳多组．第2天腹腔注射给药，假手术组与模型组给予生理盐水，其余3组给予对应药物治疗，剂量均为5 m L／kg，给药时间共计21 d．

1．5 学习记忆功能的检测

参照胡镜清等［4］方法，采用Morris水迷宫实验装置及动态图像采集分析系统进行学习记忆功能的检测．Morris水迷宫装置直径为1．2 m，圆形逃逸平台高为0．23 m，直径为0．10 m，低于水面2～3 cm，将其放置于某一象限的中央．室温24℃，水温控制在（24±2）℃，屋顶和四壁表面干净整洁，保持周围环境的安静．从给药2周后开始，历时7 d，第1天大鼠头顶做红色标记，以便计算机跟踪，适应性游泳5 min，使其习惯环境和人的抓取等相关操作，从第2天起，将大鼠面向池壁分别从水池4个象限内的固定点放入水中，由计算机记录大鼠由入水到平台的逃避潜伏期时间．若大鼠在2 min内未找到平台，需将其引导至平台上，使其停留20 s，潜伏期计为2 min．

1．6 免疫组织化学

水迷宫实验完成后第2天，迅速断头处死大鼠，取脑组织用冰中性PBS缓冲液冲洗后置于中性甲醛中固定48 h，脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后5μm厚度切片，脱蜡脱水，经体积分数为3%的H2O2处理后进行微波热修复15 min，冷却至常温，滴加一抗，湿盒内4℃孵育过夜，分别滴加试剂1，2，37℃孵育，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片．400倍光镜观察，随机选择大鼠海马CA1区5个视野，做免疫反应阳性细胞计数，以“个／视野”为单位，结果取5个视野的平均值．

1．7 图像分析及统计学处理

用NIKON倒置显微镜和Mias2000图像分析系统采集图像并进行阳性细胞计数．在每张切片随机选取5个相邻视野，求出阳性细胞的平均值．用SPSS16．0统计软件分析计算，以±s表示，组间比较采用单因素方差分析．

2 结果

2．1 手术组大鼠术后早期观察

造模后大鼠外观干瘪，瘦弱拱背，毛发竖立且疏散并失去光泽，反应迟钝，进食和运动明显减少．可出现一侧或双侧眼裂变小，共济失调，但未见明显肢体瘫痪．部分大鼠出现惊厥，抽搐后死亡，个别大鼠术中呼吸窒息死亡．数天后存活的大鼠恢复自由行动及饮食．

2．2 杏花雨对大鼠认知功能的影响

以大鼠的逃避潜伏期做为检验其学习能力的标准，随训练天数变化，潜伏期逐渐缩短或基本稳定，经统计学分析，水迷宫训练第1天，各组大鼠逃避潜伏期与假手术组比较没有差别；而第2天各组逃避潜伏时间明显缩短，且模型组与各治疗组之间有明显差别（P＜0．05）；第3天开始成绩比较稳定，与模型组比较，杏花雨b与假手术组逃避潜伏时间显著缩短（P＜0．01），杏花雨a组与金纳多组逃避潜伏时间明显缩短（P＜0．05）；另外，与金纳多组比较，杏花雨b组逃避潜伏期明显缩短（P＜0．05），与杏花雨a组的逃避潜伏期比较，无明显差别（P＞0．05），说明同等剂量下，杏花雨b组的疗效较佳，结果见表1．

表1 各组大鼠逃避潜伏期测试成绩（x±s）Tab．1 Rats of each group escape latency test scores（x±s）

2．3 各组大鼠海马Bcl－2，Bax阳性细胞数免疫组化统计结果

表2显示，假手术组大鼠海马CA1区，可见少量Bcl－2，Bax阳性细胞表达，与假手术组相比，模型组海马区Bcl－2，Bax数量明显增多（P＜0．01），但Bax阳性细胞数变化更为显著，Bcl－2／Bax（阳性细胞比值）明显降低（P＜0．05）；杏花雨a，b组，金纳多组大鼠海马CA1区Bcl－2阳性细胞表达数均高于模型组，Bax阳性细胞表达数均低于模型组，与金纳多组比较，杏花雨b组大鼠海马CA1区Bcl－2阳性细胞表达数升高（P＜0．05），Bax阳性细胞数明显降低（P＜0．05），Bcl－2／Bax明显升高（P＜0．05），杏花雨a组大鼠海马CA1区Bcl－2阳性细胞表达数升高，但差异无统计学意义（P＞0．05）；与模型组比较，杏花雨b组海马区Bcl－2阳性细胞增多（P＜0．01），Bax阳性细胞减少（P＜0．01），Bcl－2／Bax比值显著增大（P＜0．01），杏花雨a组和金纳多组海马区Bcl－2阳性细胞增多（P＜0．05），Bax阳性细胞减少（P＜0．05），Bcl－2／Bax比值明显增大（P＜0．05）．

表2 杏花雨对各组大鼠海马CAl区Bcl－2，Bax表达阳性细胞数的影响（x±s）Tab．2 Expression of Bcl－2，Bax positive cells number on each rat hippocampal of Xinghuayu effect（x±s）

2．4 各组大鼠海马Bcl－2蛋白表达免疫组化染色结果

免疫阳性细胞质内出现棕黄色颗粒，着色越深阳性反应越强．图1显示：假手术组仅有少量或者无免疫阳性细胞，着色浅．模型组免疫阳性细胞数较假手术组明显增多，着色加深．金纳多组、杏花雨a组及杏花雨b组免疫阳性细胞数较模型组显著增多，着色较深．

图1 各组大鼠海马Bcl－2蛋白表达免疫组化染色比较（×400）Fig．1 Rat hippocampal of each group Bcl－2 protein expression of immunohistochemical staining（×400）

2．5 各组大鼠海马Bax蛋白表达免疫组化染色结果

免疫阳性细胞质内出现棕黄色颗粒，着色越深阳性反应越强，结果见图2．假手术组，仅少见或者无免疫阳性细胞．模型组，免疫阳性细胞数较假手术组显著增多，着色加深．金纳多组、杏花雨a组及杏花雨b组，免疫阳性细胞数较模型组有所减少，着色也较浅．

图2 各组大鼠Bax蛋白表达免疫组化染色比较（×400）Fig．2 Rat hippocampal of each group Bax protein expression of immunohistochemical staining（×400）

3 讨论

本实验采用大鼠双侧颈总动脉反复夹闭并再通，同时腹腔注射硝普钠降低血压的方法复制模型，此法可重复性、稳定性较好，其优点为手术操作简单，动物创伤小，大鼠海马细胞有明显的变性、坏死甚至丢失，可导致大鼠学习记忆障碍明显，而无明显的运动系统损伤表现，死亡率较低，是目前较为理想的VD动物模型．

近30年来，在行为神经科学研究中，水迷宫成为最常用的实验室研究工具之一．水迷宫实验常被用于啮齿类动物神经认知疾病模型的验证和神经认知治疗可行性的评估［5］．本实验结果显示VD模型可显著延长逃避潜伏期，而杏花雨a，b 2组及金纳多组却可明显改善大鼠的学习记忆能力，其中杏花雨a组改善明显．另外，5组大鼠随着训练次数的增多，空间记忆能力增强，逃避潜伏期在缩短，说明学习锻炼也可以增强记忆能力．

引起VD的重要原因之一为脑缺血致皮质和海马损伤．VD发病时，海马CAl区神经细胞存在细胞凋亡［6］，而Bcl－2家族是细胞凋亡机制中重要的调节因子，Bax做为这一家族中重要成员，是重要的促凋亡基因，其诱导凋亡的机制为Bax同源二聚体的形成，可以加速细胞死亡［7］．另外，Bax与Bcl－2的比值也决定着细胞在受到凋亡信号刺激后是否发生凋亡［8］．本研究显示：假手术组大鼠海马CA1区可见少量或无Bcl－2，Bax阳性细胞，模型组大鼠CA1区Bcl－2，Bax阳性细胞数量增多，其中Bax变化更为明显，Bcl－2／Bax比值与假手术组相比明显降低；经杏花雨a，b组及金纳多治疗后，大鼠海马CA1区Bax阳性细胞数降低，尤其以杏花雨b组降低明显，Bax与Bcl－2的比值也较假手术组与模型组明显提高；大鼠海马CA1区Bcl－2阳性细胞数均有提高，杏花雨b组有明显提高．由此推测杏花雨通过抑制大鼠海马促细胞凋亡基因Bax表达，促进原癌基因Bcl－2表达，Bax和Bcl－2阳性细胞增多，但Bcl－2与Bax比值增大，从而降低神经元对凋亡刺激的敏感性，减少海马神经元的凋亡，提高VD大鼠学习记忆的能力．

目前临床上治疗血管性痴呆的有效药物相对较少，且价格不菲．在抗脑缺血后神经细胞凋亡方面，许多关于中药对影响神经细胞凋亡相关因素的干预研究显示出了较好的发展空间．本实验选择中药银杏叶提取物杏花雨治疗血管性痴呆，并探讨其可能的抗细胞凋亡作用机制，旨在为其临床应用提供实验室依据．

［1］ 梁淑轩，孙汉文．银杏叶资源开发利用研究进展［J］．河北大学学报：自然科学版，2003，23（2）：204－208．

LIANG Shuxuan，SUN Hanwen．Proceeding in application ofGinkgobilobaleaves［J］．Journal of Hebei University：Natural Science Edition，2003，23（2）：204－208．

［2］ 李利平，王全胜，吴艳萍，等．银杏叶提取物对学习记忆功能保护作用的研究进展［J］．军医进修学院学报，2006，27（1）：67－69．

［3］ 王蕊，杨勤飞，唐一鹏，等．大鼠拟“血管性痴呆”模型的改进［J］．中国病理生理杂志，2000，16（10）：914－916．

［4］ 胡镜清，温泽淮，赖世隆，等．Morris水迷宫检测的记忆属性与方法学初探［J］．广州中医药大学学报，2000，17（2）：117－118．

HU Jingqing，WEN Zehuai，LAI Shilong，et al．A preliminary study on the memory attribution and methodology in Morris water maze test［J］．Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，2000，17（2）：117－118．

［5］ 方松，余化霖．Morris水迷宫实验中海马相关空间学习记忆的研究进展［J］．国际病理科学与临床杂志，2010，30（4）：321－326．

FANG Song，YU Hualin．Advances in the study on hippocampus－related spatial learning and memory in Morris water maze［J］．International Jornal of Pathology and Clinical Medicine，2010，30（4）：321－326．

［6］ HARTMAN R E，LEE J M，ZIPFEL G J，et al．Characterizing learning deficits and hippocampal neuron loss following transient global cerebral ischemia in rats［J］．Brain Research，2005，1043（1－2）：48－56．

［7］ 张新颖，武变瑛，范淑娟，等．与血管性痴呆大鼠学习记忆力相关的基因表达变化［J］．医学研究与教育，2011，28（4）：78－83．

ZHANG Xinying，WU Bianying，FAN Shujuan，et al．Gene expression changes related the study memory of vascular dementia rats［J］．Medical Research and Education，2011，28（4）：78－83．

［8］ OUYMG Y B，GIFFIARD K G．Cellular neuroprotective mechamisms in cerebral ischemia：Bcl－2 family proteins and protection of mitochondrial function［J］．Cell Calcium，2004，36（3－4）：303－311．

（责任编辑：赵藏赏）

Effects of Xinghuayu on the behavior of vascular dementia rats and the expression of Bcl－2 and Bax protein of the rat hippocampus

WU Bian－ying1，LI Li－ping1，ZHANG Xin－ying2，WANG Yan3，BA Wei－song4
（1．College of Basic Medical Sciences，Hebei University，Baoding 071000，China；
2．College of Traditional Chinese Medicine，Hebei University，Baoding 071000，China；
3．Warranty Section，Pharmaceutical Inspection Institute of Shijiazhuang，Shijiazhuang，050051，China；
4．Department of Pharmacy，The People's Hospital of Dingzhou，Dingzhou 073000，China）

VD model was established by the method of repeated ischemia－Reperfusion plus Sodium Nitroprusside in Wistar rats and the protective effects of Xinghuayu were observed．The author analyzed the cognitive ability of rats with the Morris water maze，and the expression of Bcl－2 and Bax protein of the rat hippocampus with immunohistochemical staining．The results showed that compared with the pseudo－surgery rats，VD model had more increase in the expression of Bcl－2 and Bax protein of the rat hippocampus（P＜0．01）and significantly decreased in the ratio of Bcl－2／Bax．After the therapy of Xinghuayu a，b andGinkto，the number of Bax positive cells of rats hippocampal CA1 area were decreased，especially in the Xinghuayu b group（P＜0．01），whose ratio of Bcl－2／Bax was higher than the pseudosurgery group and model group（P＜0．05）．The number of Bcl－2 positive cells in rats hippocampal CA1 area of all of the group were increased（P＜0．05），especially the Xinghuayu b group（P＜0．01）．Results suggest that Xinghuayu can improve the cognitive abilities of VD rats，suggesting that there maybe relevant with the expression of Bcl－2 and Bax protein．

vascular dementia；Xinghuayu；ginkgo flavonoids；behavior；Bcl－2；Bax

R33

A

1000－1565（2012）04－0382－05

2012－03－20

河北省中医药管理局资助项目（2004037）；河北大学校内基金资助项目（2007Y05）

武变瑛（1958－），女，河北保定人，河北大学教授，主要从事器官缺血再灌注损伤、脑记忆功能及抗衰老的研究．E－mail：wuby9026＠126．com