李 锋, 黄作平, 黄学平, 王志强, 钟 琳, 周新华, 吴自勍, 朱梅刚, 赵 彤△

(1南方医科大学附属南方医院病理科，广东 广州 510515;2武警广东省总队医院肿瘤科，广东 广州 510507)

1000-4718(2012)03-0409-06

2011-10-20

2012-01-05

国家自然科学基金资助项目(No.30770908;No.81071941)

△通讯作者 Tel:020-61648228;E-mail:zhaotongketizu@126.com

BCL-6在经典型霍奇金淋巴瘤细胞株L428和过表达CD99的L428中的表达差异及其意义*

李 锋1,2, 黄作平1, 黄学平1, 王志强1, 钟 琳1, 周新华1, 吴自勍1, 朱梅刚1, 赵 彤1△

(1南方医科大学附属南方医院病理科，广东 广州 510515;2武警广东省总队医院肿瘤科，广东 广州 510507)

目的探究BCL-6在经典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin’s lymphoma，cHL)细胞株L428和过表达CD99的L428(L428-CD99+)中的表达差异及其意义。方法应用免疫细胞化学和免疫荧光共聚焦检测BCL-6和CD99在cHL细胞株L428和L428-CD99+中的表达；运用实时荧光定量PCR和Western blotting检测细胞株L428和L428-CD99+中BCL-6和CD99的表达水平；MTT实验检测L428和L428-CD99+细胞增殖能力的差异；流式细胞术检测L428和L428-CD99+细胞的凋亡差异。结果免疫细胞化学和免疫荧光共聚焦显示CD99在L428细胞中为阴性表达，在L428-CD99+细胞中为阳性表达，并定位于细胞膜；BCL-6在L428细胞为阴性表达，在L428-CD99+细胞株中为阳性表达，并定位于细胞核。Western blotting显示CD99和BCL-6在L428细胞为阴性表达，在L428-CD99+细胞为阳性表达。实时荧光定量PCR结果显示，与L428细胞相比，CD99和BCL-6 mRNA在L428-CD99+细胞中的表达量增高(P<0.01)。MTT显示L428细胞增殖能力强于L428-CD99+细胞(P<0.01)；流式细胞术显示L428-CD99+细胞凋亡较L428细胞增多(P<0.01)。结论过表达CD99诱发BCL-6表达增高，可导致L428细胞增殖能力下降及凋亡增加。

L428细胞株； CD99； BCL-6

原癌基因bcl-6位于3q27，编码706个氨基酸残基的锌指蛋白[1]。BCL-6蛋白为一核内转录因子，可作为序列特异性的转录抑制剂，参与非霍奇金淋巴瘤中弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)的发生发展[2]。CD99蛋白是一个分子量为32 000的跨膜糖蛋白，在大多数细胞表面表达。它作为一种细胞黏附分子，参与细胞黏附、凋亡过程，在肿瘤细胞的迁移、浸润、侵袭及肿瘤的发生发展过程中起重要作用[3]。文献和我们以往研究发现CD99表达缺失与经典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin’s lymphoma,cHL)的发生发展有关[4]，为此我们构建了稳定表达CD99的cHL细胞株L428(L428-CD99+)[5]。本研究在以往研究基础上，采用免疫细胞化学、免疫荧光共聚焦、实时荧光定量PCR、Western blotting等方法比较CD99和BCL-6在L428和L428-CD99+细胞之间的表达差异及其意义，从而明确在霍奇金淋巴瘤中CD99和BCL-6之间的关系及对细胞增殖和凋亡的影响。

材 料 和 方 法

1材料

1.1细胞株 cHL细胞株L428细胞由南方医科大学广东省分子肿瘤病理重点实验室保存，过表达CD99的L428细胞株L428-CD99+由课题组前期构建，L428-CTR细胞为应用脂质体转染技术转染了空载体的L428细胞，均由南方医科大学广东省分子肿瘤病理重点实验室保存。

1.2主要仪器和试剂 胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；兔抗人CD99单克隆抗体购自Abcam,鼠抗人CD99单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司,兔抗人BCL-6多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，山羊抗兔IgG/辣根酶标记、山羊抗兔IgG/FITC和山羊抗鼠IgG/TRITC购自北京中杉金桥生物技术有限公司；免疫组化SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；荧光共聚焦显微镜为Olympus FluoView 1000；流式细胞仪为Becton Dickinsion产品；总RNA提取试剂盒RNAisoTMPlus、逆转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)和荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM均为大连宝生物工程有限公司产品；Western blotting I抗稀释液、II抗稀释液和发光液均购自碧云天生物技术有限公司。

2方法

2.1细胞培养 L428细胞、L428-CD99+细胞和L428-CTR细胞在含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养基中，置37 ℃、5%CO2培养箱内培养，取对数期、生长状态良好的细胞进行实验。

2.2细胞蜡块制作 具体制作方法见参考文献[6]。

2.3免疫细胞化学 免疫细胞化学检测采用SP法，具体操作如下：细胞蜡块2 μm连续切片，石蜡切片脱蜡水化；用3%H2O2封闭内源性过氧化物酶；PBS洗后，分别用EDTA和柠檬酸溶液微波修复6 min和10 min，滴加I抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗后，滴加过氧化物酶标记的II抗，37℃孵育45 min；PBS洗后，DAB显色；苏木素复染、脱水、透明、中性树胶封片。以已知阳性片作为阳性对照，以阴性表达的细胞作阴性对照。

2.4免疫荧光共聚焦检测细胞株中CD99和BCL-6的表达差异 (1)吸取培养瓶中的细胞悬液，经离心去上清转移至1.5 mL的EP管，0.02 mol/L PBS洗涤3次，每次5 min，用4%多聚甲醛0.5 mL室温固定30 min，再用0.02 mol/L PBS洗涤3次，每次5 min；(2)0.2% Triton X-100 0.5 mL室温破膜10 min，0.02 mol/L PBS洗3次，每次5 min；(3)10% 正常山羊血清0.2 mL封闭20 min，不洗；(4)I抗孵育：工作液鼠抗CD99抗体200 μL，稀释后兔抗BCL-6抗体200 μL，4 ℃孵育过夜，第2 d室温孵育30 min，0.02 mol/L PBS洗涤4次，每次3 min；(5)II抗孵育：在暗室内操作，I抗为CD99样品加山羊抗鼠IgG/TRITC 200 μL，I抗为BCL-6样品加山羊抗兔IgG/FITC 200 μL，室温避光，加上锡箔纸，孵育1 h，0.02 mol/L PBS洗3次，每次3 min；(6)每个样品加DAPI 200 μL，室温避光孵育5 min，0.02 mol/L PBS洗2次，每次5 min；(7)100 μL PBS重悬，转移至confocal皿，激光共聚焦显微镜观察。

2.5逆转录和荧光定量PCR检测细胞株中CD99和BCL-6 mRNA的表达差异 取培养细胞悬液5 mL，离心去上清，每107细胞中加入1 mL RNAiso Plus试剂，用移液器反复吹吸，室温静置5 min，向上述裂解液加入200 μL的氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡15 s，室温静置5 min，12 000 r/min、4 ℃离心15 min。吸取上层无色上清液至一新离心管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10 min，12 000 r/min、4 ℃ 离心10 min，去上清，缓慢沿离心管壁加入1 mL预冷75 %乙醇，2 000 r/min、4 ℃离心5 min后小心弃去乙醇，室温干燥沉淀5 min，加入无RNA酶的水30 μL，待RNA完全溶解后于-80 ℃保存。CD99、BCL-6及内参照GAPDH引物序列见表1。细胞株的RNA按试剂盒步骤逆转录合成cDNA，作为模板进行荧光定量PCR 扩增，扩增程序如下：使用二步法进行检测，预变性95 ℃ 30 s；变性95 ℃ 5 s；退火58 ℃(CD99)或55 ℃(BCL-6) 34 s，共40个循环。反应结束后，立即进行扩增曲线和融解曲线分析。以GAPDH作为内参照，由公式2-ΔΔCt计算CD99和BCL-6 mRNA在这些细胞株中的相对表达量。

表1 荧光定量PCR的引物序列

2.6Western blotting检测细胞株中CD99和BCL-6的表达差异 取L428细胞、L428-CTR细胞和L428-CD99+细胞悬液，离心去上清，提蛋白前将PMSF 1 μL加入100 μL蛋白裂解液RIPA，将混合液加入细胞，冰上超声裂解细胞30次，每次大概0.5 s，间隔1 s，冰上裂解30 min，12 000 r/min离心30 min，取上清。BCA法测定蛋白浓度，酶标仪测定波长为570 nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。灌制10%分离胶，5%浓缩胶的SDS-PAGE 凝胶。吸取40 μg总蛋白，恒压80 V 30 min。当溴酚蓝前沿进入分离胶，把电压提高到120 V，继续电泳60 min直到溴酚蓝到达分离胶底部。切胶湿转恒流100 mA 120 min，将蛋白从SDS-PAGE 凝胶转至PVDF膜。TBST配制5%的脱脂奶粉封闭。用I抗稀释液按1∶100稀释BCL-6抗体，1∶1 000稀释CD99抗体，抗体和PVDF膜4 ℃孵育过夜。1 ∶5 000稀释山羊抗兔IgG/辣根酶标记II抗，孵育1 h，增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL) 显影。UVI 凝胶成像系统摄像，Image-Pro Plus 5.10软件分析。

2.7MTT检测细胞株的增殖能力 RPMI-1640培养液将L428细胞、L428-CTR细胞和L428-CD99+细胞悬液调整为4×107cells/L，接种到96孔板上，每孔加细胞悬液200 μL，每组共设置3个复孔。空白对照加PBS 200 μL。随后，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，继续培养4 h，吸去上清，每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，酶联免疫仪检测570 nm波长的吸光度值(A值)，每组实验重复3次。

2.8流式细胞术检测细胞株凋亡 取对数生长期L428细胞和L428-CD99细胞，离心去上清。将105～106个细胞悬浮于1 mL的RPMI-1640培养基中，再加入10 μL Hoechst 33342染液，混匀，37 ℃孵育15 min。加入1 mL buffer A工作液(用双蒸水将10×buffer A 稀释10倍)悬浮细胞，加入5 μL PI染液，室温避光放置5～15 min后混匀。上机，流式细胞术检测细胞的凋亡。

3统计学处理

用SPSS 13.0进行统计学处理。MTT实验采用析因分析，荧光定量PCR实验和流式细胞术测定细胞凋亡实验采用One-way ANOVA，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1免疫细胞化学检测CD99和BCL-6在细胞株中的表达

CD99在L428表达阴性(图1A)，而在L428-CD99+为阳性表达(图1B)，并定位于细胞膜；而BCL-6在L428表达阴性(图1C)，在L428-CD99+为阳性表达(图1D)，并定位于细胞核。

Figure 1. The expression of CD99 (A,B) and BCL-6 (C,D) in the cell lines of L428 (A,C) and L428-CD99+(B,D) detected by immunocytochemistry (SP,×400).

图1免疫细胞化学检测cHL细胞株L428和L428-CD99+中CD99和BCL-6的表达

2免疫荧光共聚焦检测L428和L428-CD99+细胞中CD99和BCL-6的表达

在L428细胞中，CD99表达为阴性，而在L428-CD99+细胞(图2A)表达阳性，且在细胞膜表达；BCL-6在L428细胞中表达为阴性，而在L428-CD99+细胞中表达为阳性(图2B)，且在细胞核表达。

Figure 2. The expression of CD99 (A) and BCL-6 (B) in the cell lines of L428 and L428-CD99+detected by confocal immunofluorescence (×1 000).

图2免疫荧光共聚焦检测cHL细胞株L428、L428-CTR和L428-CD99+中CD99和BCL-6mRNA的表达

3荧光定量PCR检测L428、L428-CTR和L428-CD99+细胞中CD99和BCL-6mRNA的表达

与L428和L428-CTR细胞相比，L428-CD99+细胞的CD99 mRNA表达量明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)；与L428和L428-CTR细胞相比，L428-CD99+细胞的BCL-6 mRNA表达量明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

4Westernblotting检测L428、L428-CTR和L428-CD99+细胞中CD99和BCL-6的表达

在L428细胞和L428-CTR细胞中，CD99为阴性表达，而在L428-CD99+细胞中，CD99为阳性表达；在L428细胞和L428-CTR细胞中，BCL-6为阴性表达，而在L428-CD99+细胞中，BCL-6为阳性表达，见图4。

图3荧光定量PCR检测细胞株L428、L428-CTR和L428-CD99+中CD99和BCl-6mRNA的表达

Figure 4. Expression of CD99 and BCL-6 in the cell lines of L428, L428-CTR and L428-CD99+detected by Western blotting. β-actin was used as loading control.

图4Westernblotting检测细胞株L428、L428-CTR和L428-CD99+中CD99+和BCl-6的表达差异

5MTT检测L428、L428-CTR和L428-CD99+细胞的增殖能力

MTT 法检测L428、L428-CTR和L428-CD99+细胞体外增殖能力，经析因设计方差分析，结果显示不同细胞组之间差异显著(F=427.671，P<0.01)；不同时点组对细胞体外增殖的影响差异显著(F=2029.134,P<0.01)；细胞各组与各时点两因素交互效应显著(F=75.515,P<0.01)。3组细胞经多重比较显示，L428-CD99+细胞的增殖能力低于L428及L428-CTR细胞，差异有统计学意义(P<0.05)，而L428和L428-CTR的增殖能力差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。

图5MTT实验检测细胞株L428、L428-CTR和L428-CD99+增殖能力的差异

6流式细胞术检测L428、L428-CTR和L428-CD99+细胞凋亡

结果可见L428-CD99+细胞凋亡率明显高于L428及L428-CTR细胞，差异有统计学意义(P<0.01)，而L428和L428-CTR细胞的凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)，见图6。

图6流式细胞术检测细胞株L428、L428-CTR和L428-CD99+的凋亡率

讨 论

CD99的表达缺失是cHL发生发展的重要条件之一。1998年Kim 等[4]首先发现Hodgkin/Reed-sternberg(H/RS)细胞形态的发生与CD99表达缺失有关。本课题组前期也发现cHL病变组织内的H/RS细胞及cHL细胞株L428中CD99表达缺失[7-8]，进一步证实了CD99在cHL中扮演了重要的角色。本课题组前期研究将小鼠B淋巴瘤细胞株A20的mCD99L2基因沉默，下调CD99的表达诱导了H/RS样细胞的产生[9-10]。上述研究在人和鼠验证了H/RS肿瘤细胞形态的发生与CD99表达缺失有关。本课题探究cHL细胞株L428中CD99过表达前后BCL-6的表达差异并探讨其对细胞增殖及凋亡的影响。

BCL-6 的生物学功能是调节淋巴结生发中心B细胞的分化和发育成熟，故生发中心B细胞表达BCL-6[11]。本课题揭示了过表达CD99后L428 的BCL-6表达水平增高，诱导残疾B细胞起源的cHL细胞株L428[12]向生发中心B细胞分化。BCL-6和细胞的凋亡也有着密切的关系，BCL-6的靶基因多数是抗凋亡基因如bcl-2或bcl-XL，BCL-6的表达增高往往伴随着Bcl-2或Bcl-XL的表达下降，从而导致细胞凋亡增加[13]。

本课题用荧光定量PCR、免疫细胞化学、免疫荧光共聚焦和Western blotting等方法从基因和蛋白水平验证了过表达CD99后的L428细胞BCL-6的表达水平增高，并且从MTT实验和流式细胞术检测细胞的凋亡率证实了过表达CD99后L428增殖能力减弱，细胞凋亡增加。这揭示了在L428细胞中，CD99过表达导致BCL-6的表达增高，有助于抑制细胞的增殖能力并促进细胞的凋亡，其原因可能是：一方面在cHL中NF-κB信号通路是持续激活的[14]，而BCL-6是转录因子抑制剂，可抑制cHL赖以生存的NF-кB信号通路的转录[15]，从而使cHL持续激活的NF-кB信号通路失活，从而影响细胞增殖能力和促进细胞凋亡；另一方面，Bcl-XL蛋白是一抗凋亡蛋白，在其启动子区包含BCL-6蛋白的结合位点，也就是说Bcl-XL蛋白是BCL-6的靶蛋白，所以BCL-6能直接结合bcl-XL的启动子区并抑制其表达。所以BCL-6表达增高，靶蛋白Bcl-XL表达就减少，抗凋亡的作用也减弱了，从而可促进细胞凋亡[16]。研究也显示BCL-6的表达可以作为DLBCL独立的预后因子，BCL-6在非霍奇金淋巴瘤中的高表达往往提示较好的预后[17]。Lossos等[18]研究表明在DLBCL中BCL-6蛋白高表达者比低表达者有更长的无病生存期，这也从临床上进一步证明了BCL-6有促进肿瘤细胞凋亡的作用，使预后变好。

[1] Ye BH, Rao PH, Chaganti RS, et al. Cloning ofbcl-6, the locus involved in chromosome translocations affecting band 3q27 in B-cell lymphoma[J]. Cancer Res, 1993, 53(12): 2732-2735.

[2] Zhang A, Ohshima K, Sato K, et al. Prognostic clinicopathologic factors, including immunologic expression in diffuse large B-cell lymphomas[J]. Pathol Int, 1999, 49(12): 1043-1052.

[3] Lee I, Kim MK, Choi EY, et al. CD99 expression is positively regulated by Sp1 and is negatively regulated by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 through nuclear factor-κB[J]. Blood, 2001, 97(11): 3596-3604.

[4] Kim SH, Choi EY, Shin YK, et al. Generation of cells with Hodgkin’s and Reed-Sternberg phenotype through downregulation of CD99 (Mic2)[J]. Blood, 1998, 92(11): 4287-4295.

[5] 黄作平, 何 滢, 周新华, 等.mic2/CD99基因克隆及在霍奇金淋巴瘤L428细胞株中表达[J]. 南方医科大学学报, 2009,29(12): 2407-2409.

[6] 王志强, 黄学平, 黎相照, 等. 悬浮培养细胞的细胞块制作及其应用[J]. 临床与实验病理学杂志,2009,25(6): 667-668.

[7] 李先茂, 李 燕, 赵 彤, 等. 霍奇金淋巴瘤CD99基因表达缺失的意义[J]. 第四军医大学学报,2004,25(23): 2136-2137.

[8] 沈丽佳, 何 滢, 蒋会勇,等. mic2/CD99 在经典型霍奇金淋巴瘤H/RS 细胞中的表达及与Eber-1/LMP-1相关性的研究[J].中国病理生理杂志, 2006, 22(4): 776-780.

[9] 何 滢, 沈丽佳, 李祖国, 等.mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞转化为H/RS样细胞的影响[J]. 基础医学与临床,2007,27(6):610-615.

[10]刘 芳,沈丽佳,陈小艳,等. 低表达mCD99L2鼠B淋巴瘤细胞亚系的建立及鉴定[J].中国病理生理杂志, 2008, 24( 8): 1501- 1505.

[11]Ye BH, Lista F, Lo CF, et al. Alterations of a zinc finger-encoding gene,BCL-6, in diffuse large-cell lymphoma[J]. Science, 1993, 262(5134): 747-750.

[12]Tinguely M, Rosenquist R, Sundstrom C, et al. Analysis of a clonally related mantle cell and Hodgkin lymphoma indicates Epstein-Barr virus infection of a Hodgkin/Reed-Sternberg cell precursor in a germinal center [J]. Am J Surg Pathol, 2003, 27(11): 1483-1488.

[13]Bai M, Agnantis NJ, Skyrlas A, et al. Increased expression of the bcl6 and CD10 proteins is associated with increased apoptosis and proliferation in diffuse large B-cell lymphomas[J]. Mod Pathol, 2003, 16(5): 471-480.

[14]Krappmann D, Emmerich F, Kordes U, et al. Molecular mechanisms of constitutive NF-κB/Rel activation in Hodgkin/Reed-Sternberg cells [J]. Oncogene,1999, 18(4): 943-953.

[15]Li Z,Wang X,Yu RY, et al. BCL-6 negatively regulates expression of the NF-κB1 p105/p50 subunit[J]. J Immunol, 2005,174(1):205-214.

[16]Tang TT, Dowbenko D, Jackson A, et al. The forkhead transcription factor AFX activates apoptosis by induction of the BCL-6 transcriptional repressor [J]. J Biol Chem, 2002, 277(16): 14255-14265.

[17]Chen YW, Hu XT, Liang AC, et al. High BCL6 expression predicts better prognosis, independent ofBCL6 translocation status, translocation partner, orBCL6-deregulating mutations, in gastric lymphoma[J]. Blood, 2006, 108(7): 2373-2383.

[18]Lossos IS, Jones CD, Warnke R, et al. Expression of a single gene, BCL-6, strongly predicts survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma [J]. Blood, 2001, 98(4): 945-951.

DifferentialexpressionofBCL-6incelllinesofclassicalHodgkin’slymphomaL428andL428

LI Feng1, 2, HUANG Zuo-ping1, HUANG Xue-ping1, WANG Zhi-qiang1, ZHONG Lin1, ZHOU Xin-hua1, WU Zi-qing1, ZHU Mei-gang1, ZHAO Tong1

(1DepartmentofPathology,NanfangHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2DepartmentofOncology,GuangdongProvincialArmedForcesHospital,Guangzhou510507,China.E-mail:zhaotongketizu@126.com)

AIM: To investigate the expression of BCL-6 in classical Hodgkin’s lymphoma (cHL) cell lines, L428 (negative expression of CD99) and L428-CD99+(overexpression of CD99).METHODSThe expression of CD99 and BCL-6 at protein and mRNA levels was detected in the cell lines of L428 and L428-CD99+by the methods of immunocytochemistry, confocal immunofluorescence, real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting. MTT assay was used to determine the difference of proliferation between the cell lines of L428 and L428-CD99+. Apoptosis was analyzed by flow cytometry in the cell lines.RESULTSThe results of immunocytochemistry and confocal immunofluorescence showed that the expression of CD99 and BCL-6 was negative in L428 cell line, but positive in L428-CD99+cell line. The CD99 was localized in the membrane while BCL-6 expression was in the nucleus. The results of real-time fluorescence quantitative PCR showed that the mRNA expression levels of BCL-6 and CD99 in L428-CD99+cells were significantly higher than those in L428 cells (P<0.01). MTT assay showed that the proliferation capacity of L428 cells was higher than that of L428-CD99+cells (P<0.01). More apoptotic cells in L428-CD99+cell line than that in L428 cell line (P<0.01) were found.CONCLUSIONThe increased expression of CD99 and BCL-6 may lead to lower proliferation capacity and higher apoptotic rate of cHL, which are expected to be helpful in prevention and treatment of cHL.

L428 cell line; CD99; BCL-6

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.005