刘莎莎， 高维娟， 钱 涛， 张 霞

(1承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000； 2河北化工医药职业技术学院，河北 石家庄 050026)

1000-4718(2012)09-1582-07

2012-02-10

2012-07-12

国家自然科学基金资助项目(No.81072923)

△通讯作者Tel: 0311-85110168 E-mail:gwj6088@163.com

黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马神经元凋亡及JNK3表达的影响*

刘莎莎1， 高维娟2△， 钱 涛1， 张 霞1

(1承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000；2河北化工医药职业技术学院，河北 石家庄 050026)

目的观察黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马神经元凋亡及c-Jun N末端激酶3(JNK3)表达的影响。方法四血管阻断法制备脑缺血再灌注大鼠模型。设假手术组、脑缺血再灌注模型组(模型组)、脑缺血再灌注模型+黄芪注射液组(黄芪注射液组)和脑缺血再灌注模型+黄芪注射液溶剂对照组(溶剂对照组)。除假手术组外其余3组根据再灌注时间不同又分为0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h和120 h 7个亚组。采用TUNEL法检测海马神经元凋亡，Western blotting法检测海马组织JNK3蛋白变化，real-time PCR法检测海马组织JNK3 mRNA 的表达变化。结果与假手术组比，模型组大鼠各个时点凋亡细胞数均增多(P<0.05)；与模型组比，黄芪注射液组各个时点的细胞凋亡数明显减少 (P<0.05)，而黄芪注射液溶剂对照组各个时点的细胞凋亡数无明显变化 (P>0.05)。除120 h外，模型组各时点海马组织JNK3蛋白及mRNA表达均较假手术组增加(P<0.05)；与模型组相比，黄芪注射液可减弱除120 h之外的各时点JNK3 蛋白及mRNA的表达 (P<0.05)，而黄芪注射液溶剂对照组则无明显变化(P>0.05)。结论黄芪注射液可抑制脑缺血再灌注大鼠海马神经元凋亡，其抗凋亡机制可能与下调JNK3 mRNA及蛋白表达有关。

脑缺血再灌注； 黄芪注射液； c-Jnu N末端激酶3； 海马； 细胞凋亡

脑缺血后恢复脑血流是治疗脑缺血最关键的方法，但再灌注可加重缺血脑组织的损伤，而这种损伤以细胞凋亡为主。目前脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡的发生机制仍不十分清楚，多数学者认为神经细胞的凋亡是凋亡相关基因表达的结果，并受许多内外因素的调节。c-Jun N末端激酶3(c-Jun N-terminal kinase 3,JNK3)是一种神经特异性JNK亚型，其在神经系统损伤中具有重要的作用[1]。黄芪注射液作为临床治疗缺血性脑血管病的常用药物，可抑制细胞凋亡的发生[2]，但具体机制尚未阐明。本课题组前期实验证实，黄芪注射液可抑制离体培养的缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡，但在在体情况下，黄芪注射液是否可抑制脑缺血再灌注大鼠海马神经细胞凋亡尚属未知，因此本实验通过观察黄芪注射液对全脑缺血再灌注大鼠海马神经元凋亡及JNK3表达的影响，以探讨其发挥脑保护作用的分子机制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物 清洁级健康SD雄性大鼠258只，体重220～280 g，由天津山川红实验动物科技有限公司提供，许可证号为SCXK(津)2009-0001。

1.2主要试剂和仪器 原位细胞凋亡检测试剂盒购自Roche；蛋白酶K购自Sigma；兔抗大鼠JNK3单克隆抗体购自Cell Signaling；小鼠抗大鼠β-actin购自Santa Cruz；JNK3引物及探针由上海基康生物技术有限公司设计合成；Premix Ex TaqTM实时荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物公司；黄芪注射液由成都地奥九泓制药厂生产，20 mL/支(每1 mL相当于2 g生药)，生产批号为国药准字Z51021776；其它试剂为国产分析纯。TDL-40B离心机为上海安亭科学仪器制造厂产品；DYY-6B型稳压稳流电泳仪为北京六一仪器厂产品；SLAN荧光定量PCR检测系统为上海宏石医疗科技有限公司产品。

2方法

2.1动物分组与造模 SD大鼠适应性饲养1周后随机分为4组：假手术组、脑缺血再灌注模型组(模型组)、脑缺血再灌注模型+黄芪注射液组(黄芪注射液组)和脑缺血再灌注模型+黄芪注射液溶剂对照组(溶剂对照组)，除假手术组外其余各组根据再灌注后不同时间再分为0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h 和120 h 7个亚组，每个亚组12只动物。采用四血管阻断法制备脑缺血再灌注大鼠模型：4%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉后将大鼠俯卧位固定于操作台上，在枕骨后切开皮肤，逐层分离暴露双侧第1颈椎横突翼小孔，用直径0.5 mm的电凝针烧灼双侧翼小孔内的椎动脉，造成永久性闭塞。将大鼠仰卧固定，行腹侧颈正中切口，分离双侧颈总动脉，以“4”号丝线穿线备用，缝合切口。术后恢复24 h用无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，30 min后松开微动脉夹恢复血流。以大鼠翻正反射消失、瞳孔散大作为全脑缺血成功的标准。假手术组只做皮肤切口和组织分离。黄芪注射液组脑缺血前30 min腹腔注射黄芪注射液6 mL/kg[3]，其中24 h、72 h、120 h组术后每隔24 h追加给药1次，以确保稳定的血药浓度。黄芪注射液溶剂对照组腹腔注射与黄芪注射液等量的无菌去离子水。

2.2标本制备 从各组大鼠中随机选取6只，4%水合氯醛腹腔麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取视交叉后4 mm与小脑前之间的部分即海马脑组织，石蜡包埋，冠状切片，制成4 μm厚连续切片；其余各组大鼠4%水合氯醛腹腔麻醉后，迅速断头处死，在低温修块台上分离出双侧海马组织，置于Eppendorf管中，-80 ℃保存，备用。

2.3原位细胞凋亡检测(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL) 将石蜡切片二甲苯脱蜡、乙醇脱水、蒸馏水洗2次，各5 min，PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)洗5 min，蛋白酶K(10 mg/L)滴加切片，37 ℃湿盒温育15 min，PBS洗3次，各5 min，滤纸吸干，将3%H2O2滴加切片，以除去内源性过氧化物酶，37 ℃湿盒温育30 min，PBS洗3次，各5 min，滴加TdT缓冲液和末端脱氧核糖核酸转移酶25 μL，37 ℃湿盒温育60 min，PBS洗3次，各5 min，含辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)的抗荧光素抗体37 ℃湿盒中避光孵育30 min，PBS洗3次，各5 min， DAB显色5～10 min，流动自来水充分冲洗终止显色，苏木素复染，脱水、透明、封片，显微镜观察。凋亡细胞核呈棕黄色染色为阳性。阴性对照TUNEL反应液中不加TdT，余反应同前。在400倍光镜下计数海马CA1区中1/3段内TUNEL染色阳性细胞数。定量分析方法为：光镜下计算凋亡指数(apoptotic index, AI)。AI = 凋亡细胞数/总细胞数×100% 。

2.4Western blotting法检测海马组织JNK3蛋白表达 称取海马组织，提取总蛋白，用BCA法进行蛋白定量，取25 μg样品，以12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，分离的蛋白用半干电转移法转移到PVDF膜上，5% BSA封闭过夜，兔抗大鼠JNK3单克隆抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃摇床孵育2 h。山羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000稀释)4 ℃摇床孵育1 h。洗膜后，采用化学发光法显色，用凝胶分析软件Quantity One进行分析，测定各条带灰度值，取与β-actin的比值，反映目的蛋白的表达水平。

2.5Real-time PCR法检测海马JNK3 mRNA表达 称取海马组织，用TRIzol一步法提取RNA，按PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明逆转录为cDNA。取2 μL cDNA进行荧光定量PCR，25 μL反应体系含Taq酶12.5 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0.5 μL，3 μmol/L TaqMan-MGB 探针1 μL，ddH2O 8.5 μL。内参照GAPDH上游引物5′-TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT-3′，下游引物5′-CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC-3′，扩增片段长度为134 bp。探针序列5’-(FAM) CCACGGCAAGTTCAACGGCACAGT (Eclipse)-3’。JNK3上游引物5′-CGGATTCCGAGCACAATAAAC-3′，下游引物5′-AGGGTCGTACCAAACGTTGATGT-3′，扩增片段长度为137 bp。探针序列5′-FTAAAGCCCAGCCAAGCCP-3′。反应条件为：95 ℃预变性60 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s,扩增40个循环，在60 ℃读取荧光。阴性对照将cDNA模板换成等体积的ddH2O。绝对定量的标准曲线制作：将标准品分别稀释107、106、105、104、103作为模板，反应液的配置、反应条件和参数与PCR相同。结果检测：荧光信号检测点选在60 ℃反应后单点接收荧光信号，反应结束后计算机自动描出标准品系列稀释液的扩增曲线，并根据标准曲线得出模板中内参照基因和目的基因的拷贝数。

3统计学处理

结 果

1黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马神经元凋亡的影响

TUNEL阳性染色为细胞核呈棕黄色颗粒，假手术组偶见数个散在的阳性细胞。模型组在0 h和0.5 h仅见少许阳性细胞，随再灌注时间延长于2 h开始增多，24 h达高峰，到再灌注后72 h凋亡细胞的数量开始下降；与模型组比，黄芪注射液组相应时点的凋亡细胞数减少(P<0.05)，而黄芪注射液溶剂对照组无明显差异(P>0.05)，见图1、2。

2黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马组织JNK3蛋白表达的影响

Western blotting实验结果显示，于再灌注后0 h即出现海马组织JNK3表达增强，随再灌注时间延长表达逐渐增多，至再灌注后24 h达高峰，并于再灌注后72 h开始下降。与假手术组比，除120 h外模型组各时点均有显著差异(P<0.05)；与模型组比，黄芪注射液组除120 h外其余各时点JNK3的表达均降低(P<0.05)；而黄芪注射液溶剂对照组则无明显差异(P>0.05)，见图3。

3黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马组织JNK3mRNA表达的影响

实时荧光定量PCR结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠于再灌注后0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h和72 h JNK3 mRNA的表达明显增高(P<0.05)，120 h组无明显差异(P>0.05)；与模型组相比，黄芪注射液组除120 h外的各时点JNK3 mRNA的表达均降低(P<0.05)；而黄芪注射液溶剂对照组则无明显差异(P>0.05)，见图4～6。

讨 论

脑血管病是临床常见病，多发病，是当前人类疾病三大死亡原因之一，是首位致残因素，其中缺血性脑血管病约占全部脑卒中的70%[4]。缺血性脑血管病尤其是缺血后的再灌注损伤对人类健康危害极大，神经细胞凋亡是缺血再灌注损伤后细胞死亡的重要形式。细胞凋亡是有核细胞在一定条件下启动其自身内部机制，通过内源性核酸内切酶的激活而发生的细胞死亡过程，主要以细胞皱缩、胞核凝聚以及DNA链在核小体间被活化的核酸内切酶切断、形成180～200 bp等倍体的DNA片段(寡聚核小体)为特点。本研究发现脑缺血再灌注后，在对缺血敏感的海马脑区可检测到较多的凋亡细胞，表明细胞凋亡是缺血性脑损伤中细胞死亡的途径之一，与我们既往研究结果一致[5]。此外本研究还发现黄芪注射液可减少脑缺血再灌注后的神经细胞凋亡。

脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的发生机制与兴奋性氨基酸、钙超载、自由基增多等有关[6]，但更重要、更直接的是凋亡细胞内活跃的基因表达。脑缺血再灌注损伤与其后发生的细胞凋亡之间必须要通过相应的信号转导通路来联系，其中MAPK信号通路是神经细胞凋亡发生的重要环节。JNK信号通路是MAPK家族重要成员之一，它在细胞受到胁迫性刺激而发生凋亡的过程中发挥重要的作用[7]，抑制JNK信号通路可明显抑制神经细胞凋亡，从而减轻脑缺血再灌注损伤[8]。JNK家族是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在脊椎动物，有3种编码JNK的基因jnk-1、jnk-2和jnk-3[9]，其相应的编码产物JNK1和JNK2在各种组织细胞中广泛表达，而JNK3则主要表达于脑组织[10]。JNK3是脑缺血再灌注期间神经细胞凋亡的关键信号[11]。叶冬青等[12]研究表明，缺氧缺糖/复氧复糖可通过增加JNK3的表达而诱发神经元凋亡。在自由基、兴奋性氨基酸等应激刺激下，可激活JNK通路的关键激酶，即MAPK/ERK激酶类的MKK4 (mitogen-activated protein kinases kinases 4, MKK4)、MKK7 (mitogen-activated protein kinases kinases 7, MKK7)和MAPK/ERK激酶的激酶类的MEKK1,2,3,4 (mitogen and extracellular kinase kinase 1,2,3,4,MEKK1,2,3,4)。最终导致JNK三肽区的酪氨酸与苏氨酸双磷酸化，从而使其活化并转移到细胞核[13]。激活的JNK通过刺激其下游底物改变线粒体通透性转换孔(perme ablity transition pore, PTP)的通透性，促使细胞色素C(cytochrome C, CytC)释放入胞浆，进入胞浆的CytC与胞浆的凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease-activating factor-1, Apaf - 1)以及caspase-9前体(pro-caspase-9)结合，在ATP存在条件下形成“凋亡体”复合物(CytC+Apaf-1+pro-caspase-9)，并由此激活caspase-9[14]，活性caspase-9裂解并激活caspase-3，caspase-3激活后一方面作为蛋白酶直接降解底物，另一方面激活其它caspase蛋白酶类，如caspase-6、caspase-7等，从而使细胞走向凋亡。

Figure 1. The effect ofAstragalusinjection on neuronal apoptosis in hippocampal CA1 region of cerebral ischemia reperfusion rats (TUNEL, ×400).

图1黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马神经元凋亡的影响

图2黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马CA1区神经元凋亡指数的影响

图3黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马组织JNK3蛋白表达的影响

Figure 4. Real-time PCR standard curves. A: GAPDH; B: JNK3

图4实时定量PCR标准曲线

Figure 5. Amplification curves of GAPDH and JNK3 by real-time PCR.A: GAPDH; B: cerebral ischemia reperfusion group; C: ce-rebral ischemia reperfusion+Astragalusinjection group; D: cerebral ischemia reperfusion+vehicle group.

图5实时定量PCR扩增曲线

图6黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马组织JNK3mRNA表达的影响

本实验结果显示，脑缺血再灌注模型组大鼠海马组织JNK3的表达随再灌注时间的延长逐渐增多，至24 h达到高峰后逐渐下降，与神经细胞凋亡趋势相一致，说明脑缺血再灌注引起的神经细胞凋亡可能与JNK3的过度激活有关。同时结果显示，黄芪注射液可显著抑制JNK3的表达，因此我们推测，黄芪注射液抑制脑缺血再灌注后神经细胞凋亡可能与其抑制JNK3的表达有关。黄芪注射液是临床治疗缺血性脑血管病的常用药物，疗效良好，但作用机制尚未完全阐明。有研究证实，黄芪注射液具有降低脑缺血再灌注后脑组织的兴奋性氨基酸含量、抗自由基损伤、增加NO含量、抑制Bax 蛋白表达等作用。黄芪注射液调节凋亡相关蛋白JNK3的表达及抑制脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的发生可能与其具有上述作用有关。

综上所述，黄芪注射液可通过下调JNK3的表达，抑制脑缺血再灌注引起的细胞凋亡，从而发挥脑保护作用。

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EffectsofAstragalusinjectiononneuronalapoptosisandexpressionofJNK3inrathippocampusaftercerebralischemiareperfusion

LIU Sha-sha1, GAO Wei-juan2, QIAN Tao1, ZHANG Xia1

(1DepartmentofPathophysiology,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China;2HebeiChemical&PharmaceuticalCollege,Shijiazhuang050026,China.E-mail:gwj6088@163.com)

AIM: To investigate the effects ofAstragalusinjection on neuronal apoptosis and expression of c-Jun N-terminal kinase 3 (JNK3) in the rat hippocampus after cerebral ischemia reperfusion.METHODSThe rat model of cerebral ischemia reperfusion was set up by a four-vessel occlusion method. The SD rats were randomly divided into 4 groups: sham operation group, cerebral ischemia reperfusion group (model group), cerebral ischemia reperfusion+Astragalusinjection group (Astragalusinjection group) and cerebral ischemia reperfusion+vehicle group (vehicle group). The rats in model group,Astragalusinjection group and vehicle group after transient global cerebral ischemia (30 min) were then divided into 7 subgroups according to the reperfusion time of 0 h, 0.5 h, 2 h, 6 h, 24 h, 72 h and 120 h. The apoptosis of the neuron in the hippocampus was measured by the method of TUNEL staining. The expression of JNK3 at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blotting,respectively.RESULTSCompared with sham operation group, the number of apoptotic neurons increased in model group (P<0.05). Compared with model group, the number of apoptotic neurons decreased obviously inAstragalusinjection group (P<0.05). Compared with sham operation group, the expression of JNK3 at mRNA and protein levels in the hippocampus increased obviously in model group at all time points except 120 h (P<0.05). Compared with model group, the expression of JNK3 at mRNA and protein levels in the hippocampus decreased obviously inAstragalusinjection group at all time points except 120 h (P<0.05).CONCLUSIONAstragalusinjection decreases neuronal apoptosis in rat hippocampus after cerebral ischemia reperfusion by inhibiting the expression of JNK3 at mRNA and protein levels.

Cerebral ischemia reperfusion;Astragalusinjection; c-Jun N-terminal kinase 3; Hippocampus; Apoptosis

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.009