蒿长英， 任艳玲△， 刘立萍， 宋 囡， 王智民

(辽宁中医药大学 1基础医学院，2附属第二医院，3第一临床学院，辽宁 沈阳 110032)

1000-4718(2012)09-1670-06

2012-04-18

2012-07-20

国家自然科学基金资助项目(No.30873226);教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(No.20102133110001);辽宁省高等学校优秀人才支持计划资助项目(No.LR201025)

△通讯作者 Tel: 024-31207267; E-mail: yanlingren@tom.com

左归丸含药血清通过ERK/TGF-β/Smads信号级联调控MC3T3-E1细胞增殖与分化*

蒿长英1， 任艳玲1△， 刘立萍1， 宋 囡2， 王智民3

(辽宁中医药大学1基础医学院，2附属第二医院，3第一临床学院，辽宁 沈阳 110032)

目的研究细胞外信号调节激酶(ERK)/转化生长因子β(TGF-β)/Sma和Mad相关蛋白(Smads)信号级联在左归丸含药血清干预成骨前体细胞系MC3T3-E1细胞增殖与分化中的作用。方法以倍美力为阳性对照药，对Sprague-Dawley (SD)雌性大鼠灌服高、中、低剂量的左归丸混悬液，7 d后腹主动脉取血分离含药血清。采用噻唑蓝(MTT)法检测左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞的增殖作用，采用改良钙钴染色法检测碱性磷酸酶(ALP)表达，采用茜素红染色法检测钙化结节，采用Western blotting法检测核结合因子α1(Cbfα1)和Ⅰ型胶原(ColⅠ)蛋白表达，采用real-time RT-PCR法检测TGF-β1、Smad4和Smad2 mRNA表达。结果左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞的促增殖作用呈剂量和时间相关性，其中以低剂量且体积分数为15%作用48 h后对MC3T3-E1的促增殖作用最大；左归丸含药血清能促进MC3T3-E1细胞ALP表达，增强细胞基质钙化，提高Cbfα1和ColⅠ蛋白分泌，上调TGF-β1、Smad4和Smad2 mRNA表达；加入ERK1/2信号通路特异性阻滞剂PD98059后，MC3T3-E1细胞增殖降低，ALP表达下降，细胞基质钙化减弱，Cbfα1和ColⅠ蛋白分泌降低，Smad4和Smad2 mRNA表达下调，TGF-β1mRNA表达进一步上调。结论左归丸可能通过干预ERK/TGF-β/Smads信号级联而调控成骨细胞的增殖和分化，这可能是其防治骨质疏松症的机制之一。

左归丸； 细胞外信号调节激酶类； 转化生长因子β； Smad蛋白类； MC3T3-E1细胞

细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)以及Sma和Mad相关蛋白(Sma-and Mad-related proteins,Smads)在信号网中发挥基本的作用。ERK以一种调控的方式使细胞外信号转变为细胞质或细胞核信号，激活特异的靶点和基因过程[1]。相比其它组织，转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)在骨基质中最丰富,以非活化的形式存在，从骨基质释放，在骨微环境中被激活；其由成骨细胞(osteoblast, OB)分泌，以多种形式调控骨代谢，诱导骨骼发育和骨重建[2]。Smad2/3蛋白为转录因子，与通用型Smad4蛋白结合形成异源三聚体，将TGF-β超家族[包括骨形成蛋白4(bone marphogenic protein4，BMP-4)]激活的细胞外信号转导进入细胞核以调控目的基因转录[3]。前期研究显示，补肾健脾和补肾益气生精中药可以从蛋白及mRNA水平提高大鼠OB或骨组织中的TGF-β1及其信号转导分子 Smad2和Smad4表达。买霞等[4]研究发现，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF) 可活化 Ras/ERK 信号转导通路，促进骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs) 向OB分化。本文拟探讨左归丸含药血清对小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1细胞ERK1/2和TGF-β1/Smads信号通路的干预作用，以期明确左归丸治疗骨质疏松症的机制。

材 料 和 方 法

1材料

SD雌性大鼠SPF级，180～200 g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号为SCXK(沪)2008-0016。小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1 Subclone 14购于中科院上海细胞库。

2药物、主要试剂及仪器

左归丸(上海雷允上封浜)；倍美力(Premarin,BML)结合雌激素片(爱尔兰惠氏药厂)；改良型α-MEM培养液和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(HyClone)；胰酶、MTT、PD98059(ERK1/2信号通路特异性阻滞剂)、茜素红 (Sigma)；兔抗核结合因子α1(core binding factor α1,Cbfα1)抗体和兔抗I型胶原(collagenⅠ,Col I)抗体(Abcam)；ECL发光液(Pierce)；real time RT-PCR试剂盒(TaKaRa)；引物委托TaKaRa公司设计合成，具体信息见表1。3111型CO2培养箱(Thermo)；HFsafe-1200型生物安全柜(上海力申)；DFC320型倒置显微镜(Leica)；Western blotting系统(Bio-Rad)；BioSpec-nano型紫外可见分光光度计 (岛津)；iMark型酶标仪(Bio-Rad)；Mx3000P型real-time PCR仪(Agilent)。

3主要方法

3.1含药血清的制备 将大鼠随机分为5组：空白对照组(control)30 只、左归丸高、中、低剂量组[ZG(H、M、L)]各31只和倍美力组(BML)31只。大鼠左归丸的等临床剂量为1.6 g·kg-1，此设为ZG(L)，以其2倍为ZG(M)，4倍为ZG(H)；BML组给予结合雌激素56.25 μg·kg-1；control组灌服蒸馏水10 mL·kg-1。药物制成混悬液，每天2 次灌服，持续灌胃7 d。于第8 d给药2 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，室温静置2 h，2 500 r/min 4 ℃离心20 min，收集血清，同组混匀，56 ℃水浴灭活30 min，过滤除菌，分装，-86 ℃保存。

3.2左归丸含药血清有效作用浓度和时间的筛选 MC3T3-E1细胞第3 代经胰酶消化，用含10%(V/V)FBS的基础培养液(含1×105U·L-1青霉素、100 mg·L-1硫酸链霉素的α-MEM培养液)稀释成2×108L-1的细胞悬液，以每孔200 μL接种于96孔培养板，调零孔不加细胞，24 h后换用含0.2%(V/V)FBS的基础培养液；24 h后换用含10%、15%或20%各组含药血清的基础培养液100 μL，每一浓度8复孔，继续培养24、48、72或96 h。每孔加入5 g·L-1的MTT溶液10 μL，培养箱内孵育4 h后，弃孵育液，每孔加入100 μL DMSO，振荡混匀15 min。待沉淀完全溶解后，酶标仪上490 nm测定吸光度(A)值。

3.3实验分组及药物干预 细胞随机分为control组、PD98059(PD)组、ZG(L)组、ZG(L)+PD98059组、BML组和BML+PD98059组。MC3T3-E1细胞经胰酶消化，用含10%(V/V) FBS的基础培养液稀释成2×108L-1的细胞悬液，接种。24 h后换含0.2%(V/V) FBS的基础培养液饥饿培养，使细胞同步化；24 h后换用含或不含10 μmol/L PD98059(溶于DMSO，DMSO体积浓度≤0.0001，-20 ℃避光保存)的基础培养液，预孵育30 min后加入各组含药血清，继续培养。每3 d换1次液。

3.4改良钙钴法检测MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达 ALP染色孵育液由3%β-甘油磷酸钠、2%巴比妥钠、2%无水氯化钙、2%硫酸镁和蒸馏水5 mL组成(pH 9.4)。ALP阴性对照液不含β-甘油磷酸钠。MC3T3-E1细胞以每孔500 μL接种于24孔培养板，药物干预14 d后，弃原培养液，95%乙醇固定15 min，干燥；加入新鲜配制的孵育液，于37 ℃恒温培养箱内孵育4 h；流水洗10 min；2%硝酸钴作用5 min；蒸馏水洗片刻；1%硫化铵水溶液(现配用)处理1 min；蒸馏水冲洗。晾干，显微镜下拍照(10×20)。

3.5茜素红染色法检测MC3T3-E1细胞钙化结节 0.1%茜素红溶液：茜素红100 mg，Tris-HCl (pH 8.3) 100 mL；混匀，充分溶解，4 ℃避光保存。MC3T3-E1细胞以每孔1 000 μL接种于24孔培养板，药物干预14 d后，弃原培养液，PBS洗2次；95%乙醇固定10 min；PBS洗3次；0.1%茜素红-Tris-HCl(pH 8.3) 37℃孵育30 min；自来水冲洗，室温干燥。在低倍镜视野(4×10)下拍照。

3.6MC3T3-E1细胞ColⅠ和Cbfα1蛋白表达检测 MC3T3-E1细胞第6代以每瓶3×106接种于25 cm2培养瓶，药物干预48 h后弃原培养液，蛋白提取试剂提取总蛋白，4 ℃ 12 000×g离心10 min，取上清；BCA试剂盒测定蛋白浓度；与5×SDS上样缓冲液100 ℃煮沸5 min，60 μg/well加入12%SDS-PAGE凝胶中，电泳，转膜3 h，5%质量浓度的脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，Ⅱ抗37 ℃孵育2 h，TBST洗4次，暗室中ECL发光并用X胶片曝光，胶片扫描并分析结果。

3.7TGF-β1、Smad4、Smad2 mRNA表达 RNAiso Plus试剂盒提取细胞总RNA，吸光度测定方法检测RNA质量。理想的RNA纯度A260/A280应在1.8 ～2.2范围内。基因组DNA去除体系：5 μL 200 mg/L total RNA，2.0 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1.0 μL gDNA Eraser，2.0 μL RNase Free dH2O；PCR仪反应：(1)42 ℃ 2 min；(2)4 ℃保存。RT反应体系：去除基因组DNA的总RNA，4 μL 5×PrimeScript Buffer 2(for real time)，1 μL PrimeScript RT Enzyme MixⅠ，1 μL RT Primer Mix，RNase Free dH2O 4 μL；PCR仪反应：(1)37 ℃ 15 min；(2)85 ℃ 5 s；(3)4 ℃保存。标准品cDNA 5倍梯度稀释，稀释6个梯度；各组cDNA样品5倍稀释；在每个0.2 mL 8联PCR反应管中加入23 μL PCR反应液[9.5 μL RNase Free dH2O，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，12.5 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×Tli RNaseH Plus)，并在每个反应管中加入2 μL cDNA[negative control(NTC)加2 μL EASY dilution]，PCR仪中real-time PCR反应：(1)95 ℃ 2 min；(2)95 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s，40个循环。根据NTC反应有无荧光信号检出，并结合熔解曲线确认反应体系是否有污染；标准曲线的相关系数(R2)>0.98；扩增效率(E)应在0.8～1.2范围。采用双标准曲线法换算样品中mRNA含量，再以GAPDH作为内参照计算样品中mRNA相对表达量。

表1 引物序列

4统计学处理

结 果

1左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞增殖的影响

体积分数为15%的ZG(H、M、L)含药血清对MC3T3-E1细胞的促增殖作用均明显高于10%和20%的作用。其中，以15%ZG(L)含药血清作用48 h后对MC3T3-E1细胞的促增殖作用最强(P<0.01)，且与control组比较有显著差异(P<0.05)，与BML组比无显著差异。故采用15%ZG(L)含药血清[以ZG(L)表示]进行细胞干预实验，见图1～3。

2ERK1/2信号通路对左归丸含药血清干预的MC3T3-E1细胞ALP表达的影响

细胞合成的ALP经改良钙钴法染色，呈棕黑色细微颗粒，阴性对照组无棕黑色颗粒。与control组比，ZG(L)含药血清作用于MC3T3-E1细胞14 d后，细胞密度增大，细胞突触多且长，棕黑色颗粒增多。加入PD98059后，各组与未加组比较，细胞突触明显回缩，棕黑色颗粒沉积减少，见图4。

图110%左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞增殖的影响

图215%左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞增殖的影响

图320%左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞增殖的影响

Figure 4. Involvement of ERK1/2 in MC3T3-E1 cell ALP production induced by ZG-medicated serum(×200).A：control;B：PD98059 (PD); C：ZG(L);D:ZG(L)+PD; E：BML; F：BML+PD.

图4ERK1/2信号通路对左归丸含药血清干预的MC3T3-E1细胞ALP表达的影响

3ERK1/2信号通路对左归丸含药血清干预的MC3T3-E1细胞钙化结节的影响

形成的钙化结节经茜素红染色呈红色。与control组比，ZG(L)含药血清作用于MC3T3-E1细胞14 d后，钙化结节明显增多。加入PD98059后，各组与未加组比较，钙化结节明显减少，见图5。

Figure 5. Involvement of ERK1/2 in MC3T3-E1 cell mineralization induced by ZG-medicated serum(×40).A：control;B：PD; C：ZG(L);D:ZG(L)+PD; E：BML; F：BML+PD.

图5ERK1/2信号通路对左归丸含药血清干预的MC3T3-E1细胞钙化结节的影响

4ERK1/2信号通路对左归丸含药血清干预的MC3T3-E1细胞ColⅠ和Cbfα1蛋白表达的影响

与control组比，ZG(L)能明显促进MC3T3-E1细胞ColⅠ和Cbfα1蛋白的表达(P<0.05)；加入PD98059后，各组较未加PD98059组比较，ColⅠ和Cbfα1蛋白表达明显下降(P<0.05)，见图6、7。

5ERK1/2阻滞剂对左归丸含药血清干预的MC3T3-E1细胞TGF-β1、Smad4和Smad2mRNA表达的影响

与control组比，ZG(L)与BML均能显著上调MC3T3-E1细胞TGF-β1、Smad4和Smad2 mRNA表达(P<0.05或P<0.01)；加入PD98059后，ZG(L)及BML组较未加PD98059组比较，Smad4和Smad2 mRNA表达明显下降(P<0.05)，TGF-β1mRNA表达进一步上调，且有显著差异(P<0.05)，见图8～10。

图6ERK1/2信号通路对左归丸含药血清干预的MC3T3-E1细胞Cbfα1蛋白表达的影响

图7ERK1/2信号通路对左归丸含药血清干预的MC3T3-E1细胞ColⅠ蛋白表达的影响

讨 论

1左归丸治疗骨质疏松症的机制

补肾方左归丸始载于明·张介宾《景岳全书·新方八阵·补阵》，能滋肾补阴，用于真阴不足证，症见腰酸膝软、盗汗、神疲口燥。骨质疏松发病的主要原因是雌激素缺乏引发OB的骨形成不足和破骨细胞(osteoclast, OC)的骨吸收亢进导致的骨重建失衡[5]。OB不仅决定骨的形成，同时也调节OC对骨的吸收，是骨代谢的主要功能细胞，OB增殖和分化在很大程度上决定了最终形成的骨量。赵宏艳等[6]通过体外“OC+OB+骨片”共培养的方法，观察大鼠正常组血清、卵巢切除(ovariectomized,OVX)组血清和OVX+左归丸含药血清对共培养体系的影响。其研究结果显示，在OVX状态下，左归丸含药血清对OC有直接抑制作用，且可通过OB介导对OC的抑制作用。吴昆鹏等[7]研究发现，小分子肽可通过增加骨保护素的表达来影响骨保护素/核转录因子κB受体活化因子配体系统，间接抑制OC的数量和功能。本实验结果显示，左归丸含药血清能促进MC3T3-E1细胞增殖，提高ALP活性，增强细胞基质钙化，促进Cbfα1和ColⅠ蛋白分泌，上调TGF-β1、Smad4和Smad2 mRNA表达。由此提示，左归丸可能是通过提高TGF-β1、Smad4和Smad2 mRNA水平而治疗骨质疏松症。

图8ERK1/2信号通路对左归丸含药血清干预的MC3T3-E1细胞TGF-β1mRNA表达的影响

图9ERK1/2信号通路对左归丸含药血清干预的MC3T3-E1细胞Smad4mRNA表达的影响

图10ERK1/2信号通路对左归丸含药血清干预的MC3T3-E1细胞Smad2mRNA表达的影响

2ERK1/2和TGF-β1/Smads信号通路在OB中的作用

ERK1/2信号通路主要参与细胞的增殖、转化和存活等过程[8]。近年研究发现，TGF-β能通过激活ERK信号通路在多数细胞效应中发挥作用。Okamoto等[9]研究表明，TGF-β1使ERK和Smad磷酸化，从而诱导人脑膜细胞基质金属蛋白酶9的表达，从而引发脑室内出血后的心室扩张，其中基质金属蛋白酶是水解骨胶原的特异性酶，和组织金属蛋白酶抑制因子的平衡状态调控着骨基质胶原的降解。Cicek等[10]研究发现，TGF-β处理的早期应答基因通过抑制MEK/ERK等信号通路抑制OC生存。Ghayor等[11]揭示，TGF-β通过激活ERK通路促进OB增殖，而这种效应还有赖于蛋白激酶C。朱晓峰等[12]研究MC3T3-E1前体成骨细胞株发现，淫羊藿素可以通过雌激素受体激活BMP/Smad信号通路而促进ALP、ColⅠ和骨钙素的表达。然而，对于在OB中ERK与TGF-β/Smads 级联的研究却少有报道。本实验结果显示，把ERK1/2特异性阻滞剂PD98059加入到左归丸含药血清后，MC3T3-E1细胞的ALP活性降低，钙化减弱，Cbfα1和ColⅠ蛋白分泌下降，Smad2和Smad4 mRNA表达下调，而TGF-β1mRNA表达却进一步上调。尽管大量的文献证实，Smads是TGF-β唯一的信号转导分子，但越来越多的数据暗示，独立的Smad通路也可能存在[11]。也有研究发现，TGF-β对ERK1/2的激活，下调Smads对小鼠OB细胞ALP活性和矿化的诱导[13]。因此，ERK1/2磷酸化水平降低后TGF-β1mRNA表达进一步上调的机制可能是，在左归丸含药血清干预MC3T3-E1细胞48 h的时间里，ERK1/2通过发挥正向调节作用调控Smad2 mRNA和蛋白表达，通过负反馈环路调控TGF-β1mRNA和蛋白表达；也可能是，ERK1/2能激活TGF-β1/smads通路，ERK1/2通路被阻滞后，Smad2(R-Smads)磷酸化降低，致使游离的TGF-β1增多；也可能是ERK1/2非依赖于TGF-β1而激活Smad2以发挥生物学效应。总之，ERK1/2与TGF-β1/Smads在左归丸干预MC3T3-E1细胞中的具体机制还有待于进一步研究，如增加左归丸干预的时点、优化培养条件等。

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EffectsofZuoguipill-medicatedserumonproliferationanddifferentiationofMC3T3-E1cellsviaERK/TGF-β/Smadssignalingcascade

HAO Chang-ying1, REN Yan-ling1, LIU Li-ping1, SONG Nan2, WANG Zhi-min3

(1SchoolofBasicMedicine,2theSecondAffiliatedHospital,3theFirstClinicalInstitute,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China.E-mail:yanlingren@tom.com)

AIM: To study the effects of Zuogui pill (ZG)-medicated serum on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells via ERK/TGF-β/Smads signaling pathway.METHODSUsing Premarin (conjugated estrogens tablets) as a positive control, the SD female rats were fed with high-, medium- or low-dose of ZG suspension. ZG-medicated serum was separated from abdominal aortic blood 7 d after feeding of ZG. MTT assay was applied to test the effect of ZG-medicated serum on the viability of MC3T3-E1 cells. The production of alkaline phosphatase (ALP) was detected by a modified calcium and cobalt dyeing method. The calcified nodules were observed by the method of alizarin red staining. The levels of core binding factor α1 (Cbfα1) and collagen type I (Col I) protein were analyzed by Western blotting. The mRNA expression of TGF-β1, Smad4 and Smad2 was measured by real-time RT-PCR.RESULTSZG-medicated serum promoted the proliferation of MC3T3-E1 cells in a dose-and time-dependent manner. Compared with other groups, treatment with 15% ZG (low dose) for 48 h increased the proliferation of MC3T3-E1 cells significantly. The protein levels of ALP, Cbfα1 and Col I,the calcified nodules, and the mRNA expression of TGF-β1, Smad4 and Smad2 in MC3T3-E1 cells were all significantly increased after treatment with ZG-medicated serum. After the addition of PD98059 (a specific blocker of ERK1/2 signaling pathway), all those were down-regulated except for mRNA expression of TGF-β1.CONCLUSIONZG regulates MC3T3-E1 cell proliferation and differentiation via the intervention of ERK/TGF-β/Smads signaling cascade, which may be one of the mechanisms that ZG effectively prevents and treats osteoporosis.

Zuogui pill; Extracellular signal-regulated kinases Transforming growth factor beta; Smad proteins; MC3T3-E1 cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.023