潘宏升，荀凤娇，田素飞，年 华，褚云卓＊

（1.中国医科大学附属第一医院 检 验科，辽宁 沈 阳110001；2.辽宁省第三人民医院 检 验科）

目前，全球范围内由社区相关性耐甲氧西林金黄色 葡 萄 球 菌 （community－associated methicillinresistant Staphylococcus aureus，CA－MRSA）引起的感染呈逐年上升趋势，CA－MRSA与医院相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（hospital－associated methicillin－resistant Staphylococcus aureus ，HAMRSA）存在许多不同，CA－MRSA多感染无相关危险因素的健康人群，且发病年龄较轻［1］。研究发现，HA－MRSA与CA－MRSA的mec A基因的葡萄球菌基因盒（staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）的基因型不同，HA－MRSA 多为Ⅰ－Ⅲ，CA－MRSA以Ⅳ、Ⅴ型为主［1］。本文应用SCC－mec基因分型、SPA分型、多位点序列（MLST）分析等方法，从多个角度了解CA－MRSA的分子生物学特点，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2007年1月至2008年9月门诊及住院患者连续分离、不重复非痰标本CAMRSA菌株5例，其中浓汁3份，血液2份，详细情况见表1。

1.1.2 主要试剂及仪器 细菌基因组提取试剂盒，博日生物技术有限公司；Tag酶及PCR相关试剂，宝泰克大连生物科技有限公司；PCR引物，上海生工有限公司合成；脉冲场凝胶电泳试剂，美国Bio－Rad生物科技有限公司；PCR9700（Gene Amp）；脉冲场凝胶电泳仪（美国Bio－Rad），HZQ－F160振荡培养箱（上海）；超速低温离心机（贝克曼）；紫外凝胶成像仪（美国Alpha Innotech）。

表1 5株CA－MRSA菌株来源的基本情况

1.2 方法

1.2.1 DNA模板提取 采用细菌基因组提取试剂盒，按照说明提取基因组DNA。

1.2.2 SCCmec基因分型 引物设计及反应参数等参 照 文 献［2］进 行，ClassB 上 游 引 物：5’－TATTTTTGGGTTTCACTCGG－3’，下游引物：5’－CTCCACGTTAATTCCATTAATACC－3’；ClassC上 游 引 物：5’－GAACATTGTTACTTAAATGAGCG－3’，下 游 引 物：5’－TGAAAGTTGTACCCTTGACACC－3’；Type2上游引物：5’－ATTGCCTTGATAATAGCCTCT－3’，下游：5’－TAA AGGCATCAATGCACAAACACT－3’。

1.2.3 基因序列分析 目的基因经PCR扩增阳性，片段大小与预计值相符，产物经上海生工有限公司纯化、测序，在GenBank比对确证，其中SPA分型的测 序 结 果 于 数 据 库 （http：／／www.ridom.de／spaserver／）中公布的重复序列进行比较，根据排列方式及次数确定型别。

1.2.4 多位点序列分型 扩增7个管家基因，引物及反应参数参照文献［3］进行，管家基因引物分别如下：arc－up：5’－TTGATTCACCAG CGCGTA TTGTC－3 ’， arc－dn： AGGTATCTGCTTCAATCAGCG；aro－up：5’－ATCGGAAATCCTATTTCACATTC－3’，aro－dn：5’－GGTGTTGTATTAATAACGATATC－3’；glp－up：5’－CATGGAACTGCAATCTTAATCC，glp－dn：5’－TGGTAAAATCG－CATGTCCAATTC－3’；gmk－up：5’－ATCGTTTTATCGGGACCATC－3’，gmk－dn：5’－TCATTAACTACAACGTAATCGTA－3’；pta－up：5’－GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG－3’，pta－dn：5’－GAVCCTTTTGTTGAAAAGCTTAA－3’；tpi－up：5’－TCGGTCATTCTGAACGTCGTGAA－3’，tpidn：5’－TTTGCACCTTCTAACAATTGT AC－3’；yqi－up：5’－CAGCATACAGGACACCTATTGGC－3’ yqi－dn：5 ’－CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC－3’。测序结果提交数据库 （http：／／www.mlst.net），比较每个多态性位点的等位基因，获得序列号（ST），与已知的MRSA流行株进行比较分析。

2 结果

2.1 SCCmec基因分型结果

5株CA－MRSA克隆株，SCCmec基因型Ⅳ型为3株（60%），Ⅴ型为2株（40%）。

2.2 多位点序列分型结果

3株SCCmec基因型Ⅳ型克隆株为ST59（19－23－15－2－19－20－15）；Ⅴ型克隆株1株为ST7（5－4－1－4－4－6－3），另1株未能成功进行多位点序列分型。

2.3 SPA基因多态性分型结果

3株SCCmec基因型Ⅳ型克隆株归属为t437型（r04－r20－r17－r20－r17－r25－r34），Ⅴ型克隆株归属为t163型（r04－r20－r17－r20－r17－r45－r16－r34）和t796型（r07－r23－r21－r17－r12－r23－r02－r12－r23）。

表2 5株CA－MRSA基因分型结果

3 讨论

自从1997年在纽约首次发现社区相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（CA－MRSA）引起的感染以来，全球范围内关于CA－MRSA感染的报道接连不断，其较强的传播能力和定植能力及其携带的毒力基因对于疾病的发生、发展都起到了十分重要的作用，使其极易造成感染的暴发和流行，引起发病率和死亡率升高。

目前，分子流行病学研究方法在揭示病原菌的进化及遗传特性，确定某一感染暴发流行菌株或相关基因来源，追踪基因水平的转移与播散，调查院内耐药性质粒在不同细菌间播散等方面发挥重要作用。本研究确定应用三种基因分型（PFGE、MLST及SPA）方法，全面揭示CA－MRSA流行株的基因型变化趋势及流行病学特点，同时还可以为临床经济、快速、准确确证CA－MRSA感染提供方法学依据。其中，PFGE方法是进行染色体DNA分型，将基因组的整体基因片段进行分析，主要应用于近期内引发感染疾病的菌株间同源性分析，其分辨能力强，被誉为基因分型技术的“金标准”；而 MLST揭示的是菌株长期进化、变异的结果，其主要优势在于己经建立了大型数据库，可以直接将结果提交到国际网站，与已知的流行株进行比较和分析，了解不同国家和地区间菌株的遗传相关性［4］；SPA基因分型方法是目前较有效地基因分型工具，操作方便快捷，从另一个角度描绘了CA－MRSA的进化路线［5］。

本次调查研究发现，3例SCCmecⅣ－t437型CA－MRSA菌株（P14、2997、E14）的 MLST基因型为ST59，均分离自沈阳及周边地区社区发病患者，因皮肤软组织感染而接受治疗，与美国、新加坡及中国台湾地区广泛传播的CA－MRSA菌株属于同一克隆株［6］。另外两株 CA－MRSA 菌株为SCCmecⅤ－t796型菌株（b811），MLST基因型为ST7，SCCmecⅤ－t163型菌株（5896）MLST未分出结果，表明此两株菌分别由不同菌株进化而来，在本地区流行传播，但目前相关报道较少，不排除境外携带者传播的可能性，随着国家和地区间经济文化交流的日益频繁，将会进一步促进CA－MRSA菌株间的互相“流通”，这就使得疾病的传播和变异进一步复杂化，对人群危害严重。

细菌对抗菌药物的耐药性不断增长问题备受世界关注，虽然CA－MRSA菌株在基因结构上仅携带对β－内酰胺类抗菌药物耐药的mec A基因，但相关资料表明CA－MRSA菌株对多重药物敏感率呈逐年降低趋势［6］，本研究中的5株CA－MRSA菌株不仅对青霉素、红霉素、头孢西丁抗菌药物完全耐药，对克林霉素及头孢呋辛耐药率也较高，而且对环丙沙星、庆大霉素也有不同程度耐药，表明本地区发现的多重药物敏感率下降的CA－MRSA克隆株在不断进化发展中，适应能力在不断提高。此外，不容忽视的是CA－MRSA菌株SCCmec基因片段相对小，更容易整合其他耐药基因，很容易造成大规模的疾病流行，势必将医学界推向被动局面，形势不容乐观。有必要对耐药菌株进行耐药监测，注意耐药谱变化，研究其耐药机制，指导临床正确选择抗菌药物，防止耐药菌株扩散。

［1］Jenum PA，Walberg M，Rφnning EJ，et al.An outbreak of methicillin－resistant Staphylococcus aureus infection in a maternity ward［J］.Tidsskr Nor Laeqeforen，2008，128（8）：933.

［2］Kunyan Zhang，Jo－Ann McClure，Sameer Elsayed，et al.Novel Multiplex PCR Assay for Characterization and Concomitant Subtyping of Staphylococcal Cassette Chromosome mec Types I to V in Methicillin－Resistant Staphylococcus aureus［J］.JCM，2005，5026.

［3］Mark C，Enright，Nicholas P，et al.Multilocus sequence typing for characterization of methicillin－resistant and methicillin－susceptible clones of Staphylococcus aureus［J］.J Clin Microbiol，2000，38：1008.

［4］Strommenger B，Braulke C，Heuck D，et al.spa Typing of Staphylococcus aureus as a Frontline Tool in Epidemiological Typing［J］.J Clin Microbiol，2008，46：574.

［5］范 红.三株社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因分型研究［J］.中华医学杂志，2008，88：20.

［6］Gorwitz RJ，Jernigan DB，Powers JH，et al.In the CDC－Convened Experts’Meeting on Management of MRSA in the Community［C］.2006.Strategies for clinical management of MRSA in the community：summary of an experts’meeting convened by the Centers for Disease Control and Prevention.