朱 玉 王超群 王晓华

安徽省医学科学研究院，安徽合肥 230061

正交实验法优选青皮的醇提工艺

朱 玉 王超群 王晓华▲

安徽省医学科学研究院，安徽合肥 230061

目的优选青皮的最佳醇提工艺。方法以橙皮苷为标样，采用HPLC归一化法测定出的总黄酮提取率为考察指标，先比较不同浓度的乙醇对青皮的提取效果，然后采用L9（34） 正交试验法，考察乙醇用量、提取时间及提取次数对提取效果的影响。结果60%乙醇的提取效果最好，提取次数对考察指标具有显著性影响。结论青皮的最佳醇提工艺为加8倍药材量的60%乙醇，加热回流提取3次，每次1.0 h。

正交试验；青皮；醇提工艺；橙皮苷；总黄酮；高效液相法

青皮（pericarpium citri reticulatae viride）为芸香科植物橘（citrus reticulata blanco）及其栽培的干燥幼果或未成熟果实的果皮，性味苦、辛、温，归肝、胆、胃经，具有疏肝破气、消积化滞之功能，用于胸胁胀痛、疝气、乳核、乳痈、食积腹痛[1]。青皮中含有黄酮类、氨基酸类、胺类及挥发油等成分[2]，其中含量特别高的黄酮类化合物是橙皮苷[3]；青皮醇提取物或生物活性黄酮类混合物（橙皮苷和柚皮苷）可降低鼠血浆和肝胆固醇， 肝甘油三酯水平及3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶和酰基辅酶A胆固醇转移酶（ACA T）的活性， 同时动物排泄物中性胆固醇含量也明显减少[4]。虽然有青皮总黄酮提取工艺研究的报道[5-6]，但是其总黄酮含量采用分光光度法准确度较低、重复性差[7]。本研究以橙皮苷为标样，采用HPLC归一化法测定出的总黄酮提取率为考察指标，采用正交试验法优选青皮醇提工艺，以期获得更可靠的结论。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters-600E型液相色谱仪配996型PDA二极管阵列紫外检测器（美国WATERS公司）；百万之一电子天平（美国PE公司）；SB2200-T型超声波清洗器（上海奥特赛恩斯仪器公司）；可控硅恒温水浴锅（上海锦屏仪器仪表有限公司）。

1.2 试药

橙皮苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0721-200010，供含量测定用）；青皮饮片（合肥和义堂中药饮片有限责任公司，批号：10010702）；甲醇为色谱纯；水为纯净水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 以橙皮苷为标样，采用归一化法计算青皮总黄酮含量[7]

2.1.1 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱：Shim-Pack VPODS（250 mm×4.6 mmI.D.，日本岛津有限公司）；流动相：甲醇-水（45∶55）；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；检测波长283 nm。见图1。本批青皮饮片中总黄酮的含量为9.13%。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷对照品适量，置50 mL量瓶中，加甲醇制成每毫升溶液含橙皮苷0.1 mg。

2.1.3 供试品溶液的制备 将青皮饮片粉碎成细粉，精密称取0.2 g，置50 mL量瓶中，加甲醇30 mL，超声处理30 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即可。

2.1.4 线性范围考察 精密吸取橙皮苷对照品溶液（每毫升含橙皮苷0.010 04～0.100 4 mg）各20μL，分别注入液相色谱仪中，测定其色谱峰面积积分值。以橙皮苷对照品进样量C（μg）为横坐标，相应色谱峰面积积分值A为纵坐标绘制标准曲线，回归方程A=1.890×106C +2.438×104，相关系数r=0.999 5。橙皮苷的线性范围0.200 8～2.008μg。

图1 RP-HPLC图

2.1.5 重复性试验 取橙皮苷对照品溶液，连续进样5次，测定其橙皮苷峰面积，结果相对标准偏差RSD为0.6%。

2.2 乙醇浓度的选择

取青皮饮片 10.0 g，分别加入 30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇150 mL，浸泡30 min，加热回流提取1 h，趁热过滤，放冷，准确测量提取液体积，摇匀，精密量取1.5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，超声处理10 min，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，分别注入液相色谱仪测定。结果显示60%乙醇对青皮总黄酮的提取效果最好，青皮总黄酮的提取率为30.1%。

2.3 正交试验设计

试验采用L9（34）正交方案，试验因素及其水平见表1。

表1 试验因素水平表

2.4 样品的提取

精密称取9份青皮饮片，每份10.0 g，按正交设计表所列条件加入一定体积的60%乙醇，加热回流提取一定时间后，趁热过滤，合并提取液，放冷，准确测量提取液体积，备用。

2.5 青皮总黄酮提取率的测定

将各试验提取液摇匀，精密量取适量，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，超声处理10 min，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，分别注入液相色谱仪测定。

2.6 正交试验结果及统计分析

青皮总黄酮提取率的影响因素大小顺序为C＞A＞B，即提取次数＞乙醇用量＞提取时间；因素C具有显著性影响，而因素A和B的影响不显著。其中，K3a＞K2a＞K1a，但三者相差不大，故因素A选择中间水平2，即60%乙醇的用量为8倍；K3b＞K2b＞K1b，三者相差不大，而且因素B对检测指标影响不显著，宜选择中间水平2，即提取时间为1.0 h；K3c＞K1c＞K2c，三者相差较大，而且因素C对检测指标影响显著，宜选择水平3，即提取次数为3次，因此，青皮的最佳醇提工艺为A2B2C3组合即5号正交试验，青皮总黄酮提取率达为56.31%。见表2、3。

表2 L9（34）正交试验表及结果

表3 方差分析表

3 讨论

笔者曾尝试以橙皮苷提取率作为考察指标，但是难免以偏盖全，因为分析发现各样品中不同成分峰面积之间的比例随着不同提取工艺而变化，而以橙皮苷为标样，采用HPLC归一化法测定出的总黄酮提取率为考察指标，则较为全面。此法对于大批量青皮提取物的生产过程质量监控、中间产物质量检验亦较为合适。

文献报道，采用Ca（OH）2饱和溶液提取青皮总黄酮，得到的青皮总黄酮含量为6.11%[5]，但提取过程涉及酸碱，不利于青皮黄酮类化合物天然结构的稳定；采用70%乙醇在70℃浸提的醇提方法，黄酮类化合物的提取率仅为5.56%[6]。本试验优选的醇提工艺青皮总黄酮提取率达到55%以上，可见，加8倍药材量的60%乙醇，加热回流提取3次，每次1.0 h作为青皮醇提工艺是可取的。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S]. 北京：化学工业出版社，2005：136-137．

[2]Cheng H，Liu CY，Li CY.Advances in studies on chemical constituents and pharmacologic effects of Pericarpium Citri Reticulatae Viride [J]. Chin Tradit Herb Drugs，2001， 32（11）：1050-1052.

[3]Yi LC，Xie PS，Liang YZ，et al.Studies on fingerprints of Pericarpium Citri Reticulatae Viride [J].Tradit Chin Drug Res Clin Pharm，2004，15（6）：403-406.

[4]Bok SH，Lee SH，Park YB，et al.Plasma and hepatic cholesterol and hepatic activities of 3-hydroxy-3-methyl-glu-taryl-CoA reductase and acyl CoA：cholesterol transferase are lower in rats fed citrus peel extract or a mixture of citrus bioflavonoids[J].J Nutr，1999，129 （6）：1182-1185.

[5]Zheng YM，Xu XY， Fu SQ， et al. Extraction and determination of total flavonoids from Pericarpium Citri Reticulatae Viride [J].West China Journal of pharmaceutical sciences，2007，22（5）：580-581.

[6]Zen H. Extraction of flavonoids from Pericarpium Citri Reticulatae Viride [J].Guiding J Tradit Chin Med Pharm，2009，15（6）：94-97.

[7]Zeng L，Zeng FJ，Wang W，et al.The determination for flavoneinl in Ginkgobilogal by HPLC[J]. Food Res Devel，2008，29（6）：85-88.

Orthogonal test for optimizing the extracting method of Pericarpium Citri Reticulatae Viride with alcohol

ZHU Yu WANG Chaoqun WANG Xiaohua
Anhui Institute of Medical Science,Hefei 230061,China

ObjectiveTo optimize the extraction technology of Pericarpium citri Reticulatae Viride with alcohol.Methods Compared the effect of different concentrations of alcohol on the extraction first,then studied the effective factors including the amount of alcohol of the suitable concentration,the extraction time and frequency with orthogonal test of L9(34),taking the extraction rate of total flavonoid determined by normalization method based on the standard hesperidin by HPLC as index.Results60% alcohol was selected as the extracting solvent and the extraction frequency had great influences on the index.ConclusionThe optimal extraction technology with alcohol was to extract Pericarpium citri Reticulatae Viride with 60% alcohol of 8 times the amount of medicinal material for 3 times and 1.0 hours each time.

Orthogonal test;Pericarpium Citri Reticulatae Viride;Extraction technology with alcohol;Hesperidin;Total flavonoid;HPLC

R284.2

B

2095-0616（2012）02-134-03

▲通讯作者

2011-12-09）