杨 平 林珈好 王玉蓉

北京中医药大学中药学院，北京100102

盐酸小檗碱前体脂质体的制备及理化性质研究

杨 平 林珈好 王玉蓉▲

北京中医药大学中药学院，北京100102

目的 制备盐酸小檗碱前体脂质体，并对其理化性质进行考察。 方法 采用薄膜载体沉积法制备盐酸小檗碱前体脂质体，正交实验优选处方；透射电镜观察形态；马尔文激光粒度仪测定粒径；高效液相色谱法测定包封率。结果 电镜下观察脂质体形态多为圆形或椭圆形，平均粒径为741 nm，包封率为 （29.93±1.32）%。 结论 该方法制备工艺简单，易于工业化生产。

盐酸小檗碱；前体脂质体；脂质体

小檗碱（berberine）又称黄连素，常用于治疗肠道炎症。现代研究发现它对于心律失常、高血压、高脂血症、糖尿病和肿瘤等也具有较好的治疗作用[1]。但由于盐酸小檗碱口服血药浓度低，维持时间短，难以达到有效的治疗浓度，若长期大剂量给药，又会产生诸多不良反应。1986年，英国学者Payne等[2]首次提出了前体脂质体（proliposomes）这一概念，是指将脂质材料吸附于水溶性载体上，制备成的干燥颗粒或粉末。当口服给药时，与体液接触，脂质溶胀而载体迅速溶解，在水相中形成脂质体，能促进药物的吸收[3]。为解决盐酸小檗碱吸收差及生物利用度低和普通脂质体不稳定等问题，本实验首次探讨了盐酸小檗碱前体脂质体的制备工艺并对其理化性质进行研究。

1 仪器与试药

日本岛津高效液相色谱仪（LC-20AT四元泵、CTO-10ASVP柱温箱、SPD-20A紫外检测器）；752紫外可见分光光度计（上海现科分光仪器有限公司）； RE-2000A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D（III）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；pHS-3C精密酸度计（上海伟业仪器厂） ；BSl10S型1/万电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；JEM-1230透射电子显微镜（日本电子公司）；Zetasize Nano ZS纳米粒度仪（英国马尔文）；Olympus CX21 型显微镜（日本）。

盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号110713-200911）；盐酸小檗碱提取物（四川什邡鸿鸣药物原料有限公司）；Sephadex G-50 coarse（Pharmacia进口分装）；Lipoid S75天然大豆磷脂（德国Lipoid公司，纯度＞75%）；胆固醇（Amresco分装）；麦芽糖糊精Maltrin M700（Grain Processing Corporation赠样）；乙腈（色谱纯）；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 盐酸小檗碱前体脂质体的制备

2.1.1 制备方法 采用薄膜载体沉淀法制备：称取处方量的磷脂、胆固醇及盐酸小檗碱适量，溶于无水乙醇中，形成澄明溶液。另取适量麦芽糖糊精（载体）置100 mL圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪上快速转动30 min（40～50℃）至呈流动态，分次向载体粉末中加入上述澄明溶液适量，旋转蒸发至干。置真空干燥器中干燥过夜，即得盐酸小檗碱前体脂质体，取出密闭于西林瓶中，置冰箱4℃保存，备用。取前体脂质体加适量蒸馏水水合，振摇混合均匀至呈无不溶性颗粒，即得脂质体混悬液。

2.1.2 正交设计实验 通过大量预实验，初步拟定了盐酸小檗碱前体脂质体的制备工艺。为确定最优处方，以包封率为指标，以磷脂药物比（A）、磷脂胆固醇比（B）、载体磷脂比（C）为考察因素，每个因素选择3个水平，选用L9（34）正交表进行实验。见表1。方差分析结果表明，3个因素对脂质体包封率的影响均不显著。故依据极差分析结果，确定最优水平组合为A2B2C1，即磷脂/药物为8︰1，磷脂/胆固醇为4︰1，载体/磷脂为2︰1。见表2、3。

表1 因素水平表

表2 正交实验表

表3 方差分析表

2.1.3 验证试验 按筛选的处方和工艺制备前体脂质体，测得其包封率为（29.93±1.32）%。

2.2 盐酸小檗碱前体脂质体包封率的测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈 -0.033 mol/L KH2PO4（35∶ 65），用H3PO4调至pH3.2；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：345 nm，进样 10 μL。

2.2.2 线性关系的考察 精密称取盐酸小檗碱对照品10 mg，用甲醇溶解定容于50 mL量瓶中，得0.2 mg/mL对照品储备液，精密量取储备液适量，分别稀释成 0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL 的标准溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件测定。以峰面积（y）对样品浓度（x）进行线性回归，得回归方程为：y=43 728x+382.68，R2=0.999 9，表明盐酸小檗碱在0.2～8.0μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

2.2.3 精密度试验 精密量取盐酸小檗碱对照品储备液适量，用蒸馏水稀释至浓度为2.0μg/mL的标准溶液。重复进样5次，平均峰面积为885 14，RSD为0.41%。结果表明该方法精密度良好，符合要求。

2.2.4 回收率试验 精密量取9份空白脂质体混悬液0.5 ～ 10 mL量瓶中，分别加入3个浓度的盐酸小檗碱对照品溶液，每个浓度3份，加入体积分数为 10% 的 Triton X-100乙醇溶液1 mL后，加蒸馏水定容至刻度，摇匀即得浓度为0.8、2.0、8.0 μg/mL的样品溶液，按“2.2.1”项下测定，计算加样回收率。低、中、高3种浓度的回收率分别为97.7%、98.2%和99.9%，RSD分别为1.92%、0.79%和0.19%（n=3），表明本方法回收率符合要求。2.2.5 包封率测定方法 取1.5g Sephadex G-50湿法装于0.8 cm×20 cm层析柱，用 PBS缓冲液平衡。精密移取盐酸小檗碱脂质体混悬液0.20 mL上样，PBS洗脱，流速1.0 mL/min。收集前9 mL洗脱液为脂质体部分，后10～30 mL为游离药物部分。游离部分用PBS缓冲液定容至25 mL量瓶中。按2.2.1项下方法测定盐酸小檗碱含量，即为脂质体中未包封的游离药物量。另取盐酸小檗碱脂质体混悬液0.2 mL于25 mL量瓶中，操作同前，HPLC测定盐酸小檗碱含量，此为总药量，按公式计算包封率：包封率（EE%）=（1-W游/W总）×100%（注：W总为盐酸小檗碱总药量，W游为脂质体中未包封的游离药物量）。

2.3 盐酸小檗碱前体脂质体理化性质的研究

2.3.1 前体脂质体粉末的理化性质 外观：前体盐酸小檗碱脂质体为均一、流动性较好的黄色颗粒。休止角的测定：采用漏斗法测定。测得休止角均值为34.8°，均小于40°，表明流动性良好。

2.3.2 水合后脂质体的理化性质 光学显微镜观察：吸取一滴水合后的脂质体混悬液至载玻片上，置光学显微下观察。结果显示脂质体大小形态均一。见图1。电子显微镜镜观察：取少量脂质体滴至载玻片上，用1%磷钨酸进行负染，再滴至专用铜网上，自然挥干，使粒子在铜网上浓缩沉积，用电子显微镜观察并拍摄照片。结果显示脂质体形态多为圆形或椭圆形，明显可见双分子层结构。见图2。脂质体粒径的测定：取盐酸小檗碱前体脂质体混悬液适量，用生理盐水稀释至适宜浓度，以动态光散射激光粒度电位测定仪测定脂质体的粒径大小与分布，将样品溶液加至四通比色皿的1.0 ～ 1.5 mL处，放入样品测定池中。选择测定参数，进行粒度测定，平均粒径为741 nm，分散系数为0.214。见图3。

图1 盐酸小檗碱脂质体显微照片（40×10）

图2 盐酸小檗碱脂质体透射电镜 照片（×200 00）

图3 Zetasizer Nano ZS纳米粒度仪测定结果

3 讨论

本研究选择载体沉淀法制备前体脂质体，曾考察山梨醇、甘露醇、葡萄糖、β-环糊精、氯化钠、麦芽糖糊精作为载体，结果显示采用麦芽糖糊精不仅外观较好，且负载量较大，包封率也相对较高，故确定采用麦芽糖糊精为载体。

前体脂质体的制备方法一般对于脂溶性药物包封率较高，可达90%以上，如尼莫地平为95%[4]，而对于水溶性和难溶性药物包封率普遍较低，如盐酸普奈洛尔前体脂质体水化后的包封率仅为10%[5]，利巴韦林为28%[6]，葛根素为43.53%[7]等。由于盐酸小檗碱为强酸强碱盐，水溶性脂溶性均不好，可能是导致包封率较低的主要原因。但是本研究首次尝试将盐酸小檗碱制成口服前体脂质体，成功解决了液体脂质体不稳定的问题，且制法简便、适于工业化生产，为盐酸小檗碱治疗其他疾病拓宽了剂型研究途径。盐酸小檗碱前体脂质体动物体内的吸收和生物利用度研究正在进行中。

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Preparation of berberine hydrochloride prolipsomes and study of its physicochemical properties

YANG Ping LIN Jiahao WANG Yurong
School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China

ObjectiveTo prepare berberine hydrochloride proliposomes and investigate its physicochemical properties.MethodsProliposomes were prepared by film-deposition oncarriers. Orthogonal design was used to select the optimum formulation. The shape and particle size of proliposomes were investigated by transmission electron microscope and laser scatter. The encapsulation efficiency was determined by HPLC.ResultsThe berberine hydrochloride liposome vesicles were globular or elliptic under the electronic microscopy. The average size of the liposomes was 741nm. The encapsulation efficiency was(29.93±1.32)%.ConclusionThe preparation method is simple and easily industrialized preparation .

Berberine hydrochloride;Proliposomes;Liposomes

TQ43.2

B

2095-0616（2012）02-32-03

▲通讯作者

2011-11-25）