刘玲,赖术,黎昀,黄忠仕*

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001;2.右江民族医学院，广西 百色 533000)

二苯乙烯苷对SAMP8小鼠学习记忆能力的改善作用△

刘玲1,赖术2,黎昀2,黄忠仕2*

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001;2.右江民族医学院，广西 百色 533000)

目的探讨二苯乙烯苷(TSG)对老年痴呆模型SAMP8鼠学习记忆能力的影响。方法6月龄SAMP8鼠50只，随机均分为SAMP8空白组,阳性药石杉碱甲对照组,高、中、低TSG组;6月龄SAMR1鼠10只为正常对照组。各组分别灌胃相应药物45 d后，采用Morris水迷宫方法，以逃避潜伏期、原平台象限停留时间等指标观察其行为学改变。结果SAMR1组和TSG组在试验中逃避潜伏期明显短于SAMP8空白组(P<0.05)。平台象限的停留时间和穿越原平台次数在探索试验中明显多于SAMP8空白组(P<0.05)。可视平台试验结果各组无差异。结论TSG能提高SAMP8鼠的学习记忆能力。

二苯乙烯苷；Morris水迷宫；老年性痴呆；学习记忆能力；快速老化小白鼠

老年性痴呆(AD)是一种原因未明，以认知功能减退为主要临床表现的神经系统退行性疾病。快速老化模型小白鼠(Senescence accelerated prone mouse/8,SAMP8)简称老化鼠，为一个较理想的衰老模型。SAMP8可以很好地模拟老年痴呆，其机制包括大脑皮层线粒体功能降低、海马胆碱能神经功能下降以及氧化应激等[1]。二苯乙烯苷(2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷,TSG)是何首乌中特有的生物活性成分，现代中药药理研究发现其具有较强的抗氧化、抗衰老、调节细胞凋亡等作用[2-3]，TSG能显著降低SAMP8鼠脑组织谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)含量,纠正SAMP8鼠脑区氨基酸类递质代谢的紊乱状态，使兴奋性和抑制性氨基酸神经递质最终趋向平衡[4]。本研究通过观察TSG对SAMP8小鼠学习记忆能力的影响，探讨TSG对老年性痴呆的防治作用，为今后治疗、研究老年性痴呆提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

SAMP8和SAMR1(Senescence accelerated-resistant mouse/1,正常老化小白鼠)，雄性，体重24～28 g,清洁级，由天津中医药大学第一附属医院提供(动物质量合格证号：W2-J津实动质M准字第006号)。

1.2 药物

TSG(桂林三宝药业有限公司)，石杉碱甲(浙江震元制药有限公司，批号：110203)。

1.3 仪器

Morris水迷宫(中国科学院药物研究所)。Morris水迷宫由圆形水池、平台和记录系统3部分组成，水池直径100 cm,高50 cm，内壁黑色，水温控制在(22±1) ℃。房间内光线柔和而均匀，平台位于水池等分的4个象限中的任意1个象限，且没于水下1 cm。实验期间迷宫外参照物保持不变。一摄像头置于水池中央的上方约2 m处，自动采集动物游泳图像，图像自动采集和分析系统(中国医学科学院药物研究所提供)自动分析和处理。

2 方法

2.1 动物分组与喂养

选择6月龄SAMP8雄性鼠50只,随机分为SAMP8对照组、石杉碱甲阳性药对照组、TSG高剂量组、TSG中剂量组、TSG 低剂量组，每组10只。另外，选择6月龄SAMR1雄性鼠10只,作为SAMP8的模型对照组。各组均按0.2 mL·(10g)-1体重给药。SAMP8对照组、SAMRl对照组：0.9%氯化钠溶液20 mL·kg-1；阳性药组：石杉碱甲0.02 mg·kg-1；TSG低剂量组：TSG 0.033 g·kg-1；TSG中剂量组：TSG 0.1 g·kg-1；TSG高剂量：TSG 0.3 g·kg-1。以上各组每日灌胃给药l次，连续45 d。喂养结束后采用Morris水迷宫测试空间学习记忆能力的改变。

2.2 行为学测试

2.2.1 隐蔽平台试验(hidden platform trial) 每天在固定时间将小鼠面向池壁分别从入水点放入水中，记录其在100 s内寻找到平台的时间(逃避潜伏期escape latency)，操作轻柔，避免不必要的应激刺激。历时5 d，每天3次，入池位置为平台对面象限及所邻2个象限的池壁中点。本实验将最大潜伏期设为100 s,如果小鼠在100 s未找到平台，则由实验者用手牵引其至平台上，停留30 s，逃避潜伏期记成100 s。采用每天第1次的水迷宫训练数据作为评价小鼠记忆力的指标[6]。为避免小鼠直接看见平台，在水中加入碳素墨水，每3 d换1次水。

2.2.2 探索试验(probe trial) 隐蔽平台试验结束24 h后，撤除平台，任选1个入水点将小鼠放入水中，记录其100 s游泳轨迹，计算其在原平台象限游泳时间和穿越原平台次数。

2.2.3 反向试验(reversal trial) 将平台位置移至对面象限，其余操作同隐蔽平台试验，训练3 d。

2.2.4 可视平台试验(visible platform trial) 最后1 d，让平台位置露出水面1 cm，其余操作同隐蔽平台试验。

2.3 统计学处理

应用SPSS Statistics17.0软件进行数据处理，数据以均数±标准差表示，组间比较用单因素方差分析(Analysis of variance ，ANOVA) 检验，P<0.05为有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 隐蔽平台试验

隐蔽平台试验中的逃避潜伏期反映了动物空间记忆的获得情况，即学习能力。试验第1天，采用第1次小鼠入水游泳数据，受到水的刺激大多数小鼠都绕着水池池壁游，数据没有统计学意义。通过训练次数的增加，小鼠空间学习能力显著升高，并通过空间学习建立起空间记忆[7]。从第2天起，SAMR1组的逃避潜伏期就明显短于SAMP8组(P<0.05)，说明同一种系的正常老化小鼠学习记忆能力比快速老化小鼠强。石杉碱甲组和TSG组逃避潜伏期也明显短于SAMP8组(P<0.05)，表明用药后能改善快速老化老鼠的学习记忆能力。TSG组与阳性药对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 不同组别隐蔽平台试验逃避潜伏期比较

3.2 探索试验

探索试验是Morris水迷宫中较为敏感而精确的测试方法，测量动物的记忆保持能力。SAMR1组、石杉碱甲组和TSG组的停留原平台象限时间和穿越原平台次数均明显多于SAMP8组(P<0.05)，说明正常老化小鼠和用药后各组的记忆能力比快速老化小鼠强。见图2。

图2 不同组别的小鼠探索试验的结果比较

3.3 反向试验

反向试验主要反映动物的再学习能力，其实质是动物习惯于原平台位置的脱抑制过程。试验发现通过前面试验的训练，小鼠学习能力提高，反向试验第1天SAMR1组逃避潜伏期就明显大于SAMP8组(P<0.05)。由图3可见，SAMP8组、SAMR1组和石杉碱甲组比较，差异具有统计学意义(P<0.05或0.01)，TSG组分别与SAMP8组比较，差异具有统计学意义(P<0.05或0.01)。

3.4 可视平台试验

试验发现SAMR1组、石杉碱甲组、TSG组的逃避潜伏期和SAMP8组比较(P>0.05)，差异无统计学意义，即小鼠感觉、视觉或运动功能方面的差异未对其空间学习记忆产生明显的影响。见图3。

图3 不同组别小鼠反向试验和可视平台试验逃避潜伏期的结果比较

4 结论与讨论

何首乌为传统的补益中药，具有补肝肾，益精血，延缓衰老之功效。TSG是何首乌中的主要水溶性成分,近年来发现其具有神经保护作用[8]、降血脂及抗动脉粥样硬化等作用,因此TSG可能对AD等神经退行性病变的防治具有很好的应用价值。

本实验采用经典的检测啮齿类动物学习记忆能力的Morris水迷宫实验，来观察药物TSG作用于SAMP8系小鼠后学习记忆的变化。让动物利用远侧暗示从起始位置游到水下隐匿平台，通过重复训练来评估空间学习能力。当水下平台被撤出时，通过平台象限偏爱来确定动物的参考记忆[9-10]。实验发现，隐蔽平台试验中SAMR1对照组、TSG组和石杉碱甲组逃避潜伏期均明显短于SAMP8对照组，撤出平台后在原平台象限停留时间和穿越原平台次数也大于该组。逃避潜伏期变短这说明小鼠的学习能力通过训练不断地提高，撤出平台后在原平台象限停留时间长和穿越原平台次数多则说明小鼠空间记忆能力的提高。反向试验测试的是小鼠再学习的能力，实验结果显示SAMR1组、TSG组和石杉碱甲组逃避

潜伏期明显短于SAMP8组，即表明SAMR1组、TSG组和石杉碱甲组小鼠再学习能力明显强于SAMP8组，更进一步说明药物TSG与阳性药石杉碱甲有类似的提高小鼠空间记忆的能力，其作用机制有待进一步试验证明。可视平台试验各组试验结果差异不明显，则表明各组间感觉、视觉或运动能力无明显差别。

通过对小鼠空间学习记忆的研究发现，TSG对快速老化小鼠学习记忆功能损害有明显的改善作用，为TSG的临床新用途提供了参考。

[1] 赵万红，于建春，吉新彩，等.快速老化小鼠的学习记忆缺陷及其生化机制[J].西安交通大学学报(医学版),2008，29(3):289-292.

[2] 贾新，陈建宗.二苯乙烯苷神经保护作用及其机制的研究进展[J].国际中医中药杂志，2007，29(6):347-348.

[3] 王春英.何首乌中有效成分二苯乙烯苷的研究进展[J].河北医科大学学报，2008，29(1):157-160.

[4] 黄忠仕，黎昀，黄健，等.二苯乙烯苷对SAMP8鼠脑组织氨基酸类神经递质的影响[J].右江民族医学院学报，2010,32(4):469-471.

[5] Frick KM,Baxter MG,Markowaska AL,et al.Age- related spatial reference and working memory deficits assessed in the water maze[J].Neurobiol Aging,1995,16(2):149.

[6] 罗小泉，骆利平，陈海芳，等.Morris水迷宫检测大鼠记忆力方法的探讨[J].时珍国医国药，2010,21(10):2667-2668.

[7] 郑红，王文，刘渝，等.重复Morris水迷宫训练提高大鼠空间学习能力却不影响空间记忆能力[J].神经解剖学杂志,2007，23(6):599-603.

[8] 张兰，李林，李雅莉.何首乌有效成分二苯乙烯苷对神经细胞保护作用的机制[J].中国临床康复，2004，8(1)：118-120.

[9] Charles V,Williams MT.Morris water maze procedures for assesing spatial and realated forms of learning and memory[J].Nat Protoc,2006,1(2):848-858.

[10] 胡镜清，温泽淮，赖世隆.Morris水迷宫检测的记忆属性与方法学初探[J].广州中医药大学学报，2000,17(2):117-119.

TSGonLearningandMemoryAbilitiesinSenescenceAcceleratedSAMP8Mouse

LIU Ling1, LAI Shu2, LI Yun2, HUANG Zhong-shi2

(1.GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,China; 2.YoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China)

Objective: To observe the effects of TSG on learning and memory abilities in senescence accelerated SAMP8 mouse.MethodsFifty SAMP8 at the age of 6th month were randomized into 5 groups: SAMP8 untreated control group, huperzine A control group, low-, mid- and high- dose groups of TSG, with 10 mice in each group. Another ten 6th month old SAMR1 mice were assigned to normal control group. After medication for forty-five days, Morris water maze test was used to assess the learning and memory abilities in each group.ResultsSAMR1 group escape latency is shorter than SAMP8 group significantly (P<0.05), it shows that SAMP8 group show obvious learning memory disorders. TSG treated groups significantly increased the time and times of swim in original platform quadrant in spatial probe test (P<0.05), and significantly shortened the escape latency in reverse platform quadrant test than SAMP8 group. There was no significant difference among each group in visual platform Test.ConclusionTSG could improve the learning and memory abilities in SAMP8 mice.

2,3,5,4-tetrahydroxyl diphenylethylene-2-o-glucoside (TSG); Morris water maze; Alzheimer’s disease; Learning and memory abilities; Senescence Accelerated Mouse SAMP8

广西自然科学基金(桂科自0991281)

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黄忠仕，Tel：(0776)2851959，E-mail：hzs1004@163.com

2012-04-26)