刘红梅，李 丹，郭冠亚，李可意

（北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023）

灰树花Grifola frondosa为担子菌亚门、多孔菌科，又名栗子蘑、莲花菌、千佛菌等，其主要活性成分是灰树花多糖，因其有β-(1→6)分支，具有显著的生理活性，具有抑制肿瘤生长、防止肿瘤细胞转移、防止正常细胞癌变等作用［1-7］。灰树花多糖多采用子实体的水提醇沉或菌丝体发酵工艺获得的，多糖纯度低，含色素量高，产品呈深褐色，这不仅影响灰树花多糖的纯度和品质，也影响其生物活性，同时也影响对多糖的进一步纯化和构效关系的研究。因此，非常有必要对多糖进行脱色处理。

目前常用的脱色方法包括活性炭吸附脱色和双氧水氧化脱色［8-10］，但采用活性炭吸附脱色，脱色时间较长，多糖损失较多，多糖中存在活性炭残留；采用双氧水氧化脱色，易导致多糖结构因氧化而破坏，从而影响其生物活性。大孔树脂主要利用范德华力对分子进行吸附，具有物理化学稳定性高，吸附选择性强，富集效果好，解吸条件温和，再生简便，使用周期长等诸多优点［11-18］。

本实验选择6种树脂，比较其对灰树花子实体酶解液中色素的吸附性能，筛选出较优的3种树脂，通过研究其静态吸附动力学特性以及树脂用量对色素脱除率和多糖保留率的影响，筛选出脱除灰树花子实体酶解液色素的理想树脂，并考察料液pH值、料液初始浓度、吸附温度及洗脱剂体积分数等因素对色素吸附和解吸效果的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验材料 灰树花子实体干品 (20090718)，浙江庆元食用菌研究所。纤维素酶和木瓜蛋白酶，国药集团化学试剂有限公司；果胶酶，杰辉生物技术有限公司；其他均为国产分析纯。HPD 400，AB-8，S-8，D3520，D201，DA201-C吸附树脂，天津市光复精细化工研究所。

1.1.2 实验仪器与设备 UV757CRT型紫外分光光度仪，上海精密仪器有限公司；低温低速离心机，美国Beckman公司；RE-52A/52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；FA2004精密电子天平，上海恒平科学仪器有限公司；真空干燥箱，上海精密仪器仪表有限公司；恒温水浴振荡器LTA2-SHA-2，上海浦东物理化学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 分析方法 多糖含有量的测定:苯酚-硫酸法［19］测多糖含有量，以葡萄糖为对照品，线性回归方程为:A=0.5582C+0.1895，R2=0.9997，式中A为吸光度；C为以葡萄糖计的多糖质量浓度 (mg/mL)，多糖质量浓度在0.0～1.2 mg/mL的范围内线性关系良好。

多糖保留率按式 (1)计算。

式中:M前、M后分别是树脂脱色前后料液中多糖的总量(mg)。

脱色率的测定:调节待测溶液至中性，420 nm处测吸光度，按式 (2)计算脱色率。

式中:A脱色前、A脱色后分别为脱色前后溶液的吸光度。

1.2.2 复合酶-微波辅助萃取提取灰树花多糖 灰树花子实体清水洗净，真空干燥箱60℃干燥6 h，粉碎机粉碎，分别过5目和20目筛，取颗粒度在5～20目之间的灰树花颗粒，装入清洁干燥的容器中，置于真空干燥箱中备用。

按质量比为2∶2∶1的比例称取木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶，混合均匀，超纯水溶解，得复合酶溶液，备用。

称5～20目灰树花粉200 g，加10倍超纯水，室温浸泡100 min，按复合酶与灰树花粉质量比0.4%的比例加入复合酶溶液，调pH为6.0，50℃酶解90 min。酶提取液100℃条件下灭酶10 min，冷却至室温，过滤，取滤液，得酶提多糖溶液，备用。苯酚-硫酸法测多糖质量分数＞30%。

1.2.3 大孔树脂的预处理 大孔树脂用约2倍树脂体积的5%盐酸溶液浸泡6 h，使树脂充分溶胀，蒸馏水洗至中性，然后用约2倍树脂体积的5%氢氧化钠溶液浸泡6 h，蒸馏水洗至中性，再用95%乙醇浸泡6 h，蒸馏水洗至无醇味，备用。

1.2.4 树脂的初选 精确称取4.0 g经预处理的树脂于具塞磨口三角瓶中，加入100 mL初始多糖质量浓度为1.5 mg/mL的灰树花子实体酶解液，盐酸调pH值为5.0，于恒温水浴振荡器中，180 r/min振荡120 min，4000 r/min离心，过滤，收集滤液，按1.2.2项测多糖浓度和吸光度，计算多糖保留率和脱色率。

1.2.5 吸附动力学特性测定 精确称取初步筛选出的经预处理的湿树脂各4.0 g于具塞磨口三角瓶中，加入一定质量浓度的灰树花子实体酶解液，于25℃恒温水浴振荡器中，180 r/min振荡，每隔一定时间取样，测溶液吸光度和多糖含有量，绘制静态吸附动力学曲线。

1.2.6 树脂的静态吸附 精确称取筛选出的经预处理的湿树脂4.0 g于具塞磨口三角瓶中，加入一定体积的灰树花子实体酶解液，盐酸调pH值为5.0，于恒温水浴振荡器中，180 r/min振荡，分别考察树脂浓度、溶液初始浓度、溶液pH值等条件对脱色率和多糖保留率的影响。

1.2.7 树脂的静态解吸 精确称取4.0 g筛选出的经预处理的树脂6份，分别置于具塞磨口三角瓶中，加入一定体积的灰树花子实体酶解液，盐酸调pH值为5.0，于恒温水浴振荡器中，180 r/min振荡8 h至吸附平衡 (预实验表明已达到吸附平衡)；过滤，蒸馏水洗涤树脂，除去树脂表面吸附的酶解液，滤纸吸干树脂表面的水分；加入一定体积分数分别为0、20%、40%、60%、80%和95%的乙醇溶液，25℃条件下180 r/min振荡解吸8 h，测多糖和色素含量，按式 (3)计算树脂对多糖吸附量，按式 (4)和(5)计算解吸量和解吸率。

式中:Q为多糖吸附量，mg/g；C0为料液的初始多糖质量浓度 (mg/mL)；Ce为多糖的平衡吸附浓度 (mg/mL)；m为树脂质量 (g)；V为被吸附溶液的体积 (mL)；QD为多糖解吸量 (mg/g)；Cd解吸液浓度 (mg/mL)；Vd解吸液体积 (mL)；η为树脂对多糖的解吸率。

树脂对色素的解吸率按式 (6)计算:

式中:A前、A后分别为吸附前、后料液的吸光度；A解为解析后料液的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 大孔吸附树脂的筛选 影响大孔树脂吸附性能的因素很多，包括树脂的结构、极性、比表面积、粒径、孔径及被吸附分子的极性、分子大小等。一般来说，树脂的极性与被吸附分子的极性相同或相近时吸附效果更好；树脂有较大比表面积时吸附量更大；树脂孔径是被吸附分子大小的5～6倍时吸附性能最好［16］。灰树花多糖属于中性的弱极性分子，酶解液中的色素具有较强的极性。我们选择了6种树脂，对灰树花子实体酶解液中的色素和多糖进行吸附，结果见表1。

表1 6种树脂对灰树花子实体酶解液的脱色效果

从树脂的极性来看，AB-8、S-8、DA201-C 3种树脂是极性大孔吸附树脂，具有一定的亲水结构，一般用于从非极性溶剂中吸附极性溶质。灰树花多糖提取液中的色素极性较强，因此S-8、AB-8、DA201-C型树脂脱色率比较高，这3种树脂对色素的脱出率分别为77.80%、68.01%和64.99%，多糖保留率分别为89.39%、78.49%和86.09%，而HPD400属于弱极性树脂，对色素的吸附率较低，但对多糖的吸附较强，因此多糖保留率较低，只有48.28%；D3520属于非极性树脂，对色素和多糖的吸附能力均较差。另外，从比表面积来看，DA201-C、HPD400、AB-8、D3520这4种树脂比表面积都比较大，但HPD400和D3520的孔径较小，只能吸附分子较小的色素分子，而对分子较大的色素分子的吸附能力却较弱，S-8虽然比表面积较小，但却因具有较大的孔径，因而对色素分子的吸附能力较强。

根据以上结果进行综合考虑，初步选用AB-8、S-8、DA201-C这3种树脂进行吸附试验，对树脂进行进一步筛选。

2.2 静态吸附动力学曲线 仅用吸附量来评价一种树脂的分离特性并不客观，因为在吸附时间充裕的情况下，一些树脂可能具有较大的吸附量，但达到吸附平衡的时间很长，这在工业上并不适合。因此对初选的3种树脂进行静态吸附实验，结果见图1。

图1 筛选的3种树脂的静态吸附动力学(n=2)

由图1可见，色素在3种树脂上的静态吸附动力学相似，均属于快速平衡型。在吸附初始阶段，色素在树脂上的吸附量随吸附时间的延长而快速增加，色素脱除率快速上升，但在125 min左右，树脂对色素吸附量增加缓慢，150 min时3种树脂对色素的吸附都基本达到动态平衡。而在吸附量上，S-8明显高于其它两种树脂。故选择150 min为3种树脂对灰树花多糖色素的最佳吸附时间。

2.3 树脂用量对树脂吸附效果的影响 树脂用量对灰树花子实体酶解液中色素的脱除率和多糖保留率的影响结果见图2、图3。

图2 树脂用量对灰树花多糖脱色率的影响(n=2)

由图2可知，对于初选的3种树脂，随着树脂用量的增加，色素脱除效果增强，但多糖保留率下降。当树脂用量大于40 g/L料液时，再继续增加树脂用量，色素脱除率几乎不再变化。从图3可以看出，随着树脂用量的增加，多糖损失增加，多糖保留率逐渐下降。在树脂用量相同的情况下，相对于其它两种树脂而言，S-8树脂的色素脱除率和多糖保留率都明显高于其它两种树脂，在树脂用量为40 g/L时，S-8树脂的脱色率在80%左右，多糖保留率在86%以上。

图3 树脂用量对多糖保留率的影响(n=2)

综合考虑树脂对灰树花子实体酶解液脱色率、多糖保留率的影响以及树脂的吸附动力学，选择S-8型树脂为灰树花子实体酶解液的脱色树脂，树脂用量为40 g湿树脂/L酶解液，最佳的吸附时间为150 min。

2.4 吸附温度对S-8树脂吸附效果的影响 吸附温度对S-8树脂吸附效果的影响见图4。由图4可以看出，S-8树脂对色素的脱除有一个最适温度，即40℃时脱色效果最好。因为随着温度的升高，色素分子的扩散速度加快，多糖溶液黏度下降，有利于色素的吸附。但树脂对色素的吸附过程是一个放热过程，温度过高，色素的解吸速度也加快，当色素解吸速率大于树脂对色素的吸附速率时，会导致色素吸附量下降，脱色率降低。同时，温度的升高有利于灰树花多糖中的醇羟基电离，使灰树花多糖溶液的酸度增加，从而有利于弱碱性树脂对其进行吸附，因此，随着温度的升高，多糖保留率逐渐降低。综合考虑脱色率和多糖损失率，控制吸附温度为40℃。

图4 温度对S-8型树脂脱色率、多糖保留的影响(n=2)

2.5 灰树花子实体酶解液的pH对S-8树脂吸附效果的影响 灰树花子实体酶解液的pH值对S-8树脂的脱色率和多糖保留率的影响见图5。由图5可以看出，pH值对多糖的脱色效果和多糖保留率的影响都较大。在中性和弱碱性条件下，树脂对色素的吸附效果要好于酸性条件，在pH为7～8时，色素脱除率在70%以上。说明在中性或弱碱性条件，更有利于色素的脱除，这是因为灰树花子实体酶解液中的大部分色素为弱碱性物质，随着pH增加，色素被释放出来，游离的分子数增加，从而加快了树脂对色素的吸附。而多糖保留率随着pH的增大而降低，但在pH为7.0～8.0时，多糖保留率也在80%左右。因此，S-8型树脂对灰树花子实体酶解液中色素脱除的最佳使用pH值为7.0～8.0。

图5 pH值对灰树花子实体酶解液的脱色率、多糖保留率的影响(n=2)

2.6 灰树花子实体酶解液的初始多糖浓度对S-8树脂吸附效果的影响 灰树花子实体酶解液的初始多糖质量浓度对S-8树脂吸附效果的影响见图6。从图6可以看出，在料液质量浓度为2.0～6.0 mg/mL的范围内，随着料液浓度的增大，在同样条件下，树脂对色素的吸附会逐渐达到动态平衡，当料液质量浓度达到4.0 mg/mL时，再继续增大料液质量浓度，脱色率基本保持在70%左右；而当料液初始质量浓度在2.5～4.0 mg/mL时，多糖保留率基本保持在85%左右。因此综合考虑脱色率和多糖保留率的结果，选择初始多糖质量浓度为4.0 mg/mL。

图6 料液的初始质量浓度对多糖保留率、脱色率影响(n=2)

综合上述单因素试验结果，S-8树脂用于灰树花子实体酶解液中色素脱除的较佳工艺参数为:树脂用量为40 g湿树脂/L酶解液，料液初始多糖质量浓度控制在4.0 mg/mL，pH 7.0～8.0，吸附温度40℃，180 r/min振荡150 min。

2.7 优化条件的验证试验 取100 mL初始多糖质量浓度为4.0 mg/mL的灰树花子实体酶解液，按照上述优化结果，进行验证性实验，实验重复3次，测定脱色前后多糖含量和溶液吸光度，得到3次实验的平均色素脱除率为89.5%，RSD为1.97%，平均多糖保留率达到87.9%，RSD为2.36%。

2.8 树脂的再生 在利用树脂进行吸附脱色工艺中，树脂的再生至关重要。洗脱剂可以使大孔树脂溶胀，消弱被吸附物质与树脂间的吸附力，从而使被吸附物质脱附、溶解。常用的洗脱剂通常包括低级醇、酮或其水溶液，如甲醇、乙醇、丙醇和丙酮等，考虑食品生产安全性方面的要求，本试验采用乙醇作为洗脱剂，解吸液用量和质量浓度对色素和多糖解吸率的影响结果见图7和表3。由图7可知，随着乙醇溶液质量浓度的增加，乙醇溶液对色素和多糖的解吸能力均逐渐增强，色素和多糖的解吸率增大，当乙醇量达到30%时，乙醇对色素和多糖的解吸能力达到60%以上，随着乙醇质量浓度的进一步增大，解吸率继续增大，当乙醇体积分数达到80%时，解吸率达到70%以上。由表3可见，随着解吸液用量的增加，色素和多糖解吸率都呈上升趋势，当解吸液用量达到10.0 mL/g湿树脂时，色素和多糖的解吸率都在90%以上，大部分被吸附色素和多糖都从树脂中游离出来，当树脂用量增加到12.5 mL/g湿树脂时，色素和多糖解吸率增加不多。综合以上实验结果，采用浓度为30%、用量为10 mL/g湿树脂作为解吸液，对树脂进行再生。

图7 乙醇质量浓度对多糖和色素解吸率的影响(n=2)

表3 解吸液的用量对色素和多糖解吸率的影响(n=2)

3 结论

3.1 在筛选的6种大孔树脂中，S-8树脂对灰树花子实体酶解液中色素的吸附速率快，色素脱出率高，而对多糖的吸附较小，多糖保留率较高，是一种较理想的色素吸附剂，可用于脱除灰树花子实体酶解液中的色素。

3.2 S-8树脂用于灰树花子实体酶解液中色素的脱除的较佳工艺参数为:树脂用量为40 g湿树脂/L酶解液，料液初始多糖质量浓度控制在4.0 mg/mL，pH 7.0～8.0，吸附温度40℃，180 r/min振荡150 min。验证实验结果表明，根据优化工艺进行实验，色素脱除率达到89.5%，RSD为1.97%，多糖保留率达到87.9%，RSD为2.36%。

3.3 采用质量浓度为30%、用量为10 mL/g湿树脂的乙醇作为解吸液，对树脂进行再生，色素和多糖解吸率都在90%以上。

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