刘宁 宋磊 陈文芳 刘红军

重组大肠杆菌高密度生产G-CSF发酵工艺优化

刘宁 宋磊 陈文芳 刘红军

目的优化重组人粒细胞集落刺激因子，以获得工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高表达。方法 借助正交实验，在14L发酵罐中，研究重组人粒细胞集落刺激因子工程菌在添加不同浓度钾盐、钠盐和镁盐后对质粒稳定性和目的蛋白表达的影响。结果在高浓度盐的环境下，菌株的比生长速率和质粒稳定性均显著提高，从而提高目的蛋白的表达量。结论获得一种高效生产人粒细胞集落刺激因子的方法。

粒细胞集落刺激因子;高盐效应;高密度发酵;质粒稳定性

1 材料

1.1 菌株 重组大肠杆菌GCSF/pET23a/BL21(DE3)由本实验室保存。

1.2 试剂 胰蛋白胨、酵母浸出粉为Oxoid公司产品，IPTG、氨苄青霉素(AMP)为Sigma公司产品，其余均为国药集团分析纯试剂。

1.3 培养基 LB液体培养基(蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，NaCl 5 g/L)、LB固体培养基(LB液体培养基+20 g琼脂/L)、发酵基础培养基((NH4)2HPO44 g/L，酵母浸出粉 1 g/L，KH2PO414 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，葡萄糖 2 g/L，微量元素10 ml/L，氨水和稀硫酸调节pH至7.0±0.2)。微量元素储备液(FeSO4·7H2O 1 g/L，MnSO4·H2O 1 g/L，ZnSO4·7H2O 2.78 g/L，CoCl2·6H2O 2 g/L，Na2MO4·2H2O 2 g/L，CuSO45H2O1.85 g/L，H3BO30.5 g/L)。发酵补料培养基1(葡萄糖600 g/L)，发酵补料培养基2(酵母浸出粉100 g/L，Mg-SO4·7H2O 200 g/L，KCL 150 g/L，NaCL 150 g/L)。培养基中AMP的工作浓度为100 mg/L。

1.4 仪器与设备 美国NBS 14 L发酵罐，天津医疗二厂WM-2H无油空压机，日立连续流离心机，尤尼柯紫外可见分光光度计，Bio-Rad蛋白质电泳仪和凝胶成像分析系统。

2 方法

2.1 种子培养 种子的活化和培养为:将-70℃甘油冻存菌转接于5 ml LB液体培养基震荡培养，OD600为0.6～1.0时按1∶100转接于25 ml LB液体培养基继续培养，OD600为0.6左右，转接于800 ml LB，37℃，摇床培养过夜。

2.2 发酵工艺 800 ml种子液接种于8L基础培养中，发酵过程中使用氨水和稀硫酸控制pH为7.0，温度37℃，转速由初始220rpm最高升至800rpm以维持溶解氧浓度(DO)，必要时通纯氧以保证DO高于30%。……