DNA指纹图谱技术在中药研究中的应用进展

2012-10-25张晓峰刘福艳

药学研究 2012年12期

张晓峰，刘福艳

(1.山东大学管理学院，山东济南250100;2.山东省食品药品检验所，山东济南250101)

1985年，英国科学家杰佛雷斯(Jeffreys)利用人类微小卫星区的DNA进行了生物个体与种属的鉴别，并首次把这一技术称之为DNA指纹(DNA fingerprinting)图谱技术［1］。众所周知，绝大多数的中药材都是植物体、动物体和菌物体，而一切生命体都可以从基因水平或者说DNA水平上进行刻划，因此，DNA分子水平上的指纹最能从本质上表征中药材自身特征。DNA指纹图谱技术是一种在分子水平上、以药材基因型特征为鉴定指标的新技术，它直接分析遗传物质DNA本身，是分析生物的基因型而非表现型，排除了环境因素给药材鉴定带来的干扰，也不受样品形态(药材原植物、饮片或粉末)和材料来源的影响，比传统的方法(性状、显微、理化鉴定)更准确可靠，它不仅能区分相近物种(同科、同属不同种)，而且可以检测外形极为相似的同种不同变种、变型、品系、化学型乃至个体之间的DNA的细微变异。这一技术近年来正越来越广泛地被应用于中药研究中［2］。本文结合有关文献，综述了DNA指纹图谱的概念、原理、发展历程及近年来在中药质量研究领域的应用进展情况，为相关研究提供参考。

1 DNA指纹图谱的概念与原理

DNA指纹图谱技术是将个体的染色体DNA用限制性内切酶消化，分离得到不同大小的DNA片段，再以重复序列中的共有序列作为核酸探针进行杂交，对所得到不同生物个体相似DNA片段的带型图谱(即DNA指纹图谱，对每一个体都是独特的)进行分析的方法。该技术能揭示并比较生物个体间关系的密切程度，有效地应用于遗传分析、种质鉴定等方面。不同种生物体含有不同的DNA序列，同种生物体既有相同的DNA序列，保持同种生物体的遗传性状，又具有多态性，这种多态性可以是个体、种属或变异等引起的，它使得同种生物中的各个体千差万别，生物多样性正是由于其基因多态性的结果。在分子水平上检测基因多态性，比形态、组织和化学水平上检测更能代表其变异类的遗传标记，其鉴别结果更加准确可靠。DNA指纹技术灵敏度高，如果选择合适的扩增引物，其结果的重复性也非常好［2］。

2 DNA指纹图谱技术的发展历程

DNA指纹研究始于二十世纪八十年代初期，是一种称作限制性片段长度多态性(英文缩写RFLP)［3］的标记技术。在细胞中有一种特殊的酶——限制性核酸内切酶，它可以把DNA切割成长度不同的片段。这种酶有一个特点，就是它只能在DNA的特定位点上进行切割，而且，只能识别这些特异的位点。在长期的进化过程中，不同种属的生物体中DNA上的这些限制性核酸内切酶的切割位点是各不相同的，因此，当用一种限制性核酸内切酶对某种生物体DNA进行切割时，就会产生一系列长度不同的酶切片段，形成该种生物特异的DNA指纹图谱，这种指纹图谱就叫做RFLP图谱。不同种生物的RFLP图谱是不同的，因此，根据RFLP图谱就可以进行中药材的品种鉴定。RFLP技术是发展最早的DNA指纹标记技术，其缺点是实验步骤繁琐，费时费力，应用不便，价格昂贵。

1985年，美国科学家穆里斯(Mullis)发明了一种称之为聚合酶链式反应(PCR)的技术［4～6］。这种技术是先人工合成一对几个至十几个核苷酸长的寡核苷酸引物，利用这对引物和DNA聚合酶，在有四种脱氧单核苷酸存在的条件下，就可以将要扩增的DNA片段进行指数倍地扩增，而这一切只在试管中就可以完成。

在PCR技术的基础上，1990年，威利姆斯(Williams)发明了另一种新的DNA指纹图谱技术——随机扩增多态性DNA(英文缩写RAPD)技术［7］。与PCR技术中合成一对引物不同的是，在RAPD技术中，是合成一系列9－10个核苷酸长的核苷酸排列顺序随机的单链引物，然后，用这些引物对基因组DNA进行PCR扩增。由于不同种属生物可扩增出的DNA片段与长度的不同，就可以形成代表这种生物自身特征的指纹图谱，从而可以进行生物物种的鉴定。因此，RAPD技术广泛用于中药DNA指纹图谱的构建，在目前绝大多数药用动植物DNA序列还未知的情况下，RAPD技术具有广阔的应用前景。PCR技术的诞生使目的基因极易获得，再与RFLP联用，还产生了PCR－RFLP、RAPD－RFLP等方法。

20世纪90年代荷兰科学家Pieter Vos［8］等发明、发展了高效检测DNA多态性的新方法，称为扩增片段长度多态性DNA(Ampli－ fied Fragment Length Polymorphism，AFLP)。AFLP是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记，与RFLP、RAPD比较，AFLP法构建的DNA指纹图谱在操作前不需要提供序列信息，而且具有效率高、重复性好、灵敏度高的优点，其所检测到的大多数扩增片断与基因组的单一位置对应，显示了AFLP技术特别适合中药品种鉴定的应用价值和广阔前景。

SSR(Simple Sequence Repeats)标记技术是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。在真核生物中，存在许多2～5 bp简单重复序列，称为“微卫星DNA”，其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多态性。SSR具有以下一些优点:①一般检测到的是一个单一的多等位基因位点;②微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子;③所需DNA量少。

ISSR(inter－ simple sequence repeat)是 Zietkeiwitcz［9］等于1994年发展起来的又一种微卫星基础上的分子标记。ISSR引物的开发不像SSR引物那样需测序获得SSR两侧的单拷贝序列，开发费用降低。与SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物种间通用，不像SSR标记一样具有较强的种特异性;与RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可与RFLP相媲美，检测非常方便，因而是一种非常有发展前途的分子标记。目前，ISSR标记已广泛应用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究中。

3 DNA指纹图谱在中药研究中的应用

近年来，中医药工作者将DNA指纹图谱技术引入到自己的研究领域，并取得了令人瞩目的成果，对中医药学的现代化进程产生了积极的推动作用。

3.1 名贵中药材鉴定、道地性研究中药材真伪鉴别及道地品种鉴定是目前DNA指纹图谱技术在中药研究中应用最多的一个领域。随着掺伪技巧越来越高，有时单凭传统的经验鉴别方法已难以辨别真伪，常规理化鉴别又存在着用样量大，操作复杂，专属性不强等缺点。DNA指纹图谱技术以其取样量小、减少贵重样品损消耗、鉴定结果准确、灵敏性高等特点越来越受到人们的重视，近年来成为中药材鉴定的重要研究手段。中药材的质量除了与药材特定的生长环境和特殊的采收加工技术有关外，还与该药材产区内这一物种的地方种群或居群中遗传上的特殊性有关，这就是药材的“道地性”。但以前对道地药材“道地性”的研究仅限于化学、药理学方面。通过DNA指纹标记技术和化学、药理学手段结合对道地药材进行研究，并进一步对遗传因素和环境因素在药用植物有效成分形成中的地位及其相互作用的关系进行研究，能更好地对道地药材、名优药材进行品质评价。表1列举了DNA指纹图谱技术在中药鉴定分析及道地性鉴别中的部分应用。

表1 DNA指纹图谱技术中药遗传分析及鉴定中的部分应用实例

3.2 药种质资源的研究和遗传育种药用植物种质资源是一切可用于药物开发的植物遗传资源，是所有药用植物物种资源的总和。种质资源是基因的载体，植物种内所有个体及遗传性状的基因构成了该物种的种质资源。对于遗传多样性水平较低的品种，应尽可能获得更多的变异类型，可在自然界中寻找、收集变异植株，或通过分子生物技术手段增加其自然变异率，如体细胞克隆变异、γ或UV射线致突变、原生质体培养等方法。DNA指纹技术可用于药材个体或群体的变异观察。分析这些变异类型的遗传分化程度及遗传多样性水平，对药材的选种有重要意义［2］。通过DNA指纹技术分析药材不同品种的遗传关系及其差异性，在探明物种遗传背景和亲缘关系的基础上，为中药材物种资源的分析和评价及药效学相关基因和抗病基因的定位提供重要信息，推动药材遗传育种的进程，同时为今后分离有价值的药用动植物目的基因打好基础，并为构建药用动植物基因库提供资料。王志安［25，26］等通过采取及栽培中药材白术样品，采用AFLP指纹分析技术，获得了3 003条白术的多态性扩增条带，建立了中药白术种质的AFLP指纹图谱分析体系，为我国道地药材白术的种质保存和育种提供证据。其他如石斛［27］、绞股蓝［28］、丹参［29］、缬草［30］等药用植物都有应用 DNA 指纹图谱对其种质资源进行分析的报道，为进一步应用DNA指纹图谱进行资源鉴定和中药育种学提供参考。

3.3 活性成分基因表达调控的研究生物体内的各种功能蛋白质和酶都是相应基因编码、表达的产物，研究中药材活性成分基因的差异表达对其不同特性、调控机理及基因功能的研究都有重要意义。药用植物的生长周期是基因在一定的时空中表达的结果，伴随着相应的次生代谢化学成分的产生。DNA指纹图谱技术对于阐明药用植物不同生长期的分子调控机制有积极的意义，通过与cDNA等技术结合，可以达到筛选品质基因，增加有效次生代谢产物合成量，提高药材品质的目的。

4 讨论与展望

综上所述，DNA指纹图谱技术已经逐渐成为中药材研究中的重要工具和手段。随着DNA指纹技术的逐渐完善，其特异性和信息量逐渐增加，检测的精确度越来越高，对于分子水平上鉴定中药真伪、道地性研究、遗传分析和育种以及有效成分的基因表达调控等方面的研究产生了划时代的意义，具有广阔的前景。随着新技术的出现和各技术间的相互结合使用，DNA指纹图谱技术将会在中药研究中发挥更大作用。

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