李 丹，郑军红，李金敏，程秀芳，谷 巍

(山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000)

肠黏膜通透性是指分子由非载体依赖扩散的方式通过肠道上皮细胞层的过程，也是指某一特定物质在肠黏膜表面通过非易化扩散方式渗透的能力［1］。有研究［2，3］表明，肠黏膜通透性的改变可发生在肠道出现明显的炎性改变前。肠道炎症加重时，肠黏膜通透性则进一步明显增加。肠黏膜屏障是机体内外联系的重要界面，若在各种病理因素作用下肠黏膜受损则引起肠内外多种炎性失调，引起肠黏膜损伤、萎缩，肠通透性增加，肠道菌群失调［4］，尤其体现在溃疡性结肠炎、感染性结肠炎及肠外等疾患，肠黏膜屏障的改善对这些疾病不仅有助于控制病情，提高疗效，对危重疾病的发生、发展、转归也有十分重要的意义。本研究选用该公司菌种保藏中心两株乳酸杆菌(植物乳杆菌BLP、嗜酸乳杆菌2467)经过严格筛选鉴定，并通过体外模拟胃肠环境抗性、体外抑菌能力等优选菌株，最终确定为我们的实验用菌。通过D－乳酸的测定，研究灌胃乳酸菌菌液对右旋葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium，DSS)诱导的急性溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)小鼠肠黏膜通透性的影响，为临床应用益生菌治疗UC提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性昆明种小鼠60只，鼠龄6～7周，体重18～22 g，购于山东泰邦生物制品有限公司(许可证号:SCXK(鲁)2009－0004);葡聚糖硫酸钠购自MP Biomedicals公司;血D－乳酸试剂盒购于上海越研生物;菌株由本公司菌种保藏中心提供。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型建立 给小鼠5%DSS溶液自由饮用7d制备急性溃疡性结肠炎模型［5］，造模前2 d进行治疗观察。将60只昆明种小鼠随机分为4个组，正常对照组:自由采食饮水，无菌0.9%氯化钠溶液灌胃;模型对照组:自由饮用5%DSS溶液，无菌0.9%氯化钠溶液灌胃;乳酸菌(植物乳杆菌BLP)1组:自由饮用5%DSS溶液，并且每日菌液(5×109cfu·mL－1，15 mL·kg－1)灌胃;乳酸菌(嗜酸乳杆菌 2 471)2组:自由饮用5%DSS溶液，并且菌液(5×109cfu·mL－1，15 mL·kg－1)灌胃，共 9 d。

1.2.2 受试物制备 将乳酸菌以2%接种量接种到MRS培养基中，37℃静置厌氧培养24 h，活菌计数。菌液4 000 r·min－1离心 10 min，离心上清液配制成浓度5 ×109cfu·mL－1。

1.2.3 检测指标

1.2.3.1 疾病活动指数评分 疾病活动指数评分［6］(disease activity index，DAI)，DAI=(体质量下降分数+大便性状分数+便血分数)/3;正常大便为干而小粒状，半稀便为糊状但不粘肛门，稀便为液状而且黏肛门，大便隐血用联苯胺法检测。体质量下降分数分为5级，0分:无下降，1分:下降1% ～5%，2分:下降6% ～10%，3分:下降11% ～15%，4分:下降＞15%;大便性状正常记为0分，半稀便记为2分，稀便记为4分;便血阴性为0分，隐血阳性为2分，肉眼血便为4分。

1.2.3.2 标本的采集与处理 实验第9天小鼠摘眼球取血，游离并取出结肠，迅速剖开，用预冷无菌生理盐水冲洗干净，于结肠处剪取1 cm长结肠，10%的中性甲醛固定液固定。石蜡包埋、切片，HE染色，进行组织学损伤评分(colon mucosal damage index，CMDI)，共分为5级，0 分:正常结肠黏膜，1分:隐窝腺体丢失1/3，2分:隐窝腺体丢失2/3，3分:隐窝腺体全部丢失，黏膜上皮完整，伴有轻度炎细胞浸润，4分:黏膜上皮糜烂、破坏，伴有明显炎细胞浸润。

1.2.4 统计方法 实验数据采用SPSS13.0软件进行处理，测定实验结果用均数±s标准差表示。

2 结果

2.1 疾病活动指数评分 正常对照组小鼠活动如常、毛发有光泽、饮食量正常、体重增加，DAI始终稳定在低水平。模型对照组小鼠精神萎靡、毛发无光泽、饮食量减少，体重下降，并且出现稀便、血便，DAI呈逐渐上升趋势，第9天达到最高值。制剂1、2组小鼠一般状况随治疗给药时间延长逐渐好转，饮食量增加，血便减少或消失，DAI值均低于模型对照组，第7天DAI有明显降低。由表1可见，模型组小鼠DAI值明显高于正常对照组(P＜0.01)，乳酸菌1、2组与模型组比较降低(P＜0.01)，乳酸菌1、2组组间差异不显著(P＞0.05)。

表1 小鼠DAI值、CMDI值及血D－乳酸含量

2.2 组织学损伤评估

如图1～4所示:正常对照组小鼠结肠可见黏膜上皮细胞完整，腺体排列整齐，隐窝正常;模型对照组可见炎症主要累及黏膜、黏膜下层，上皮细胞缺失，浸润的炎症细胞以中性粒细胞为主，黏膜下层增厚，水肿严重;乳酸菌1、2组小鼠结肠黏膜仍有少量炎细胞浸润，腺体排列基本整齐，黏膜上皮细胞相对完整，有局部脱落，水肿较轻。

2.3 血D－乳酸含量 D－乳酸是细菌发酵的代谢产物，肠道多种细菌均可产生。当肠道发生急性缺血等损伤致肠黏膜绒毛顶端上皮脱落，细胞旁路径增加而致肠黏膜通透性增加时，肠道中细菌产生的大量D－乳酸通过受损肠黏膜进入血液中，而哺乳动物不具备将其快速降解的酶系统，通过检测血清D－乳酸浓度，能有效判断肠黏膜修复及评估肠道通透性改变情况。由表1可见，模型对照组D－乳酸水平显著高于正常对照组，黏膜通透性明显增加。乳酸菌1、2组与模型对照组比较是降低的，并且差异显著。说明灌胃植物乳杆菌BLP、嗜酸乳杆菌2467菌液对小鼠肠黏膜通透性有改善。

3 讨论

益生菌是对健康有益的活菌或活菌性膳食补充剂，利用益生菌的内源性防御屏障和免疫性防御屏障作用拮抗致病菌来保护肠黏膜屏障，促进肠上皮细胞黏蛋白及sIgA的分泌，修复肠道黏膜屏障等作用，减少菌群易位和降低内毒素浓度等。孙莹杰［7］等研究发现益生菌可在一定程度上抑制炎性反应，降低大鼠小肠黏膜通透性和细菌易位率，从而改善大鼠小肠黏膜屏障功能。王旭霞［8］等研究发现双歧杆菌可通过降低肠道通透性，调节抑制细胞因子，对大鼠结肠炎肠道黏膜发挥保护作用。White等［9］报道乳酸杆菌属(LP299)在防止肠壁通透性的发展中也起到了重要的作用。

为了探讨本实验两株乳酸菌对小鼠肠道黏膜通透性的改变，我们建立了DSS诱导的小鼠UC模型。造模过程中，小鼠出现体重下降、稀便、便血，解剖发现结肠黏膜充血、水肿、糜烂、出血及小溃疡形成等类似人类UC的症状，病理组织学切片可见肠上皮细胞和腺体破坏，有炎症细胞浸润等，符合急性炎症的组织病理学改变，说明所建立的小鼠急性UC模型是成功的。

肠黏膜通透性增加时肠道中细菌所产生的大量D－乳酸通过受损黏膜进入血液循环，因此D－乳酸水平可以反映肠道屏障功能变化［10］。通过对小鼠乳酸杆菌菌株发酵液灌胃处理，UC症状比模型对照组出现的晚且症状较轻，小鼠血D－乳酸浓度较模型对照组明显降低，提示补充植物乳杆菌BLP、嗜酸乳杆菌2467可降低UC小鼠肠黏膜通透性，促进肠黏膜屏障恢复。肠黏膜通透性的改善有助于控制病情，提高疗效，对危重疾病的发生、发展、转归也有十分重要的意义，本研究为乳酸菌预防保健、临床治疗改善肠壁通透性提供了理论支持。

［1］吴承堂，黄祥成，黎沾良.肠通透性增高与肠道细菌移位［J］.世界华人消化杂志，1999，7(7):605 －606.

［2］OlsonT S，Reuter B K，Scott K G，et al.The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source［J］.J Exp Med，2006，203(3):541 －552.

［3］Arrieta MC，Madsen K，Doyle J，et al.Reducing small intestinal permeability attenuates colitis in the IL－10 gene－ deficient mice［J］.Gut，2009，58(1):41 －48.

［4］中华医学会消化病学分会.肠屏障功能障碍临床诊治建议［J］.中华消化杂志，2006，26(9):620.

［5］曹玲芝，马利芹，王丽叶，等.建立动物腹泻模型的研究进展［J］.安徽农业学，2008，36(26):11383－11385.

［6］Murano M，Maemura K，Hirata I，et al.Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappa B(p65)antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium(DSS)－ induced colitis［J］.Clin Exp Immunol，2000，120(1):51 －58.

［7］孙莹杰，曹惠鹃，张铁铮，等.益生菌对体外循环后大鼠肠黏膜通透性和细菌易位的影响［J］.沈阳部队医药，2010，23(4):224.

［8］王旭霞，赵曙光，刘震雄，等.双歧杆菌对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜屏障功能及细胞因子的影响［J］.山西医科大学学报，2011，42(8):621.

［9］Anderson RC，Cookson AL，McNabb WC，et al.Lactobacillus plantarum MB452 enhances the function of the intestinal barrier by increasing the expression levels of genes involved in tight junction formation［J］.BMC Microbiol，2010，10:316.

［10］蔡元坤，秦新裕.D－乳酸与肠道屏障功能［J］.国外医学:外科学分册，2004，31(6):331－335.