程宇坤，白建荣，张效梅，任 元，王秀红

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030032；3.山西省农业科学院现代农业研究中心，山西太原030031；4.山西省农业科学院农作物品种资源研究所，山西太原030031）

糯玉米又叫黏玉米、蜡质玉米，其主要特点是籽粒中的淀粉全为支链淀粉。糯玉米具有许多优良特性，品质极佳。随着人们生活水平的不断提高，糯玉米作为鲜食玉米越来越受到人们的喜爱，并且其市场需求也越来越大。因此，糯玉米将是发展特色农业的良好资源。许多研究结果表明，糯玉米仅分布于亚洲东部，我国是糯玉米种质的起源地，且拥有非常丰富的糯玉米种质资源[1]，但我国糯玉米育种工作起步较晚。目前，糯玉米自交系多是将农家糯玉米品种通过杂交、回交等方法导入到普通玉米骨干系中，或者直接利用糯玉米杂交种选育而成，多数自交系无系谱可查，自交系间的亲缘关系也并不清楚。最初的遗传多样性研究采用形态标记、系谱分析、配合力表型及同工酶等方法，但这些方法在进行遗传变异分析时均存在不同程度的局限性，因此，严重限制了我国糯玉米育种工作的进一步突破。

近年来，SSR标记技术已被证明是分析种质资源多样性并对其进行类群划分的有效手段，并在玉米种质资源研究中得到广泛利用和认可。借鉴对普通玉米自交系的研究方法，利用SSR标记技术研究糯玉米种质资源将有利于进一步在分子水平上确定糯玉米种质资源的利用价值。前人已经通过SSR标记对糯玉米遗传多样性和杂种优势群的划分进行了研究。王鹏文等[2-3]利用SSR标记分别分析了30，40个糯玉米自交系的遗传多样性。陈坤等[4]利用48份糯玉米自交系遗传多样性的SSR标记将糯玉米划分为6类群，同时借助普通玉米自交系杂种优势划分的研究方法，利用SSR标记和适合的标准测验种，可以有效地将不同来源的糯玉米自交系划分到相应的种质类群中，对指导糯玉米育种有重要参考价值。研究表明，SSR标记应用于糯玉米遗传多样性分析和杂种优势类群划分的研究是可行的。

山西省地形复杂，形成了许多生态小气候。山西省农科院农作物品种资源研究所经过多年培育，育成大量适合山西省当地生长的糯玉米自交系，到目前为止，还未从分子水平上对其进行遗传阐释，即揭示其遗传多样性、对其进行分类，并研究这些糯玉米自交系与我国现有的几大玉米种质间的关系。本研究通过SSR标记技术分析山西省糯玉米自交系的遗传多样性，并进行杂种优势类群的划分，旨在为提高杂交组配的科学性、提高育种效率和育种水平，为糯玉米种质改良利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料分为2大部分：（1）6份标准测验种，包括黄早 4，Mo17，丹 340，B73，掖 478 和齐319，分别代表唐四平头群、兰卡斯特群（Lancaster）、旅大红骨群、Reid 群、PA群、PB群；（2）52 份山西省常引用和自选的糯玉米自交系。

1.2 糯玉米DNA的提取

采用CTAB法提取叶片基因组DNA，每份材料提取10株。用蛋白核酸定量测定仪测量DNA的浓度和质量，并将DNA样品质量浓度稀释至20 ng/μL，-20℃保存备用。

1.3 引物选择

采用建立国家玉米品种指纹库的20对标准引物（引物1～20）作为基本核心引物[5]，按照扩增条带清晰、多态性强、扩增带型稳定、在染色体上均匀分布的原则筛选出来的20对引物（引物21～40）为辅助核心引物[6-10]，另外选取其他较好的引物9对（引物41～48）。

1.4 PCR扩增

扩增反应在美国BIORAD公司的PT100上进行。PCR反应体系为：反应总体积20μL，其中，2 μL10×PCR Buffer（含Mg2+），1 μL 2.5 mmol/L dNTPs，1 μL 10 μmol/L SSR 引物，0.1 μL Taq DNA聚合酶，4 μL DNA模板，剩余用ddH2O补全。PCR扩增程序为：95℃预变性5 min，1个循环；94℃变性1 min，55℃复性30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后于72℃延伸10 min，放入4℃冰箱备用。

用6%聚丙烯酰胺变性凝胶进行扩增产物的电泳分析，恒定功率为60 W。凝胶通过固定、水洗、银染、显影等步骤完成染色并于室温干燥。在白炽灯下观察电泳结果，同时进行数据统计和扫描照相。

1.5 一致性检测

将供试材料各随机选取5株，用国家20对标准引物筛选进行一致性检测。在每一个引物的谱带上以多数单株（＞3株）有的带型作为每一份材料的带型。如果在每一份材料能找到20对引物都有确定带型的单株，则将这些单株作为这份材料的代表株。如果用5株不能确定某个引物的带型，则要扩大到10株。如果在某份材料不能找到20对引物都有确定带型的单株，则这份材料将没有代表株。

1.6 数据分析

SSR扩增带型以0，1，9统计，建立数据库。在相同迁移率位置上，有带记为1，无带记为0，缺失记为9。按Nei和Li的方法计算自交系间的遗传相似系数：GGS＝2Nij/（Ni＋Nj）；遗传距离：GGD＝1－GGS。其中，GGS为遗传相似系数；Ni为 i品种出现的谱带数；Nj为j品种出现的谱带数；GGD为遗传距离。按Smith等提供的公式计算多态性信息量（Polymorphism information content，PIC），即 PPIC＝1-∑fi2。按 UPGMA（Unweighted pair group method rithmetic averages）方法进行聚类分析。所有数据处理均由ntsys-pc 2.10e和Excel软件完成。

2 结果与分析

2.1 SSR标记分析

本研究首先采用建立国家玉米品种指纹库的20对标准引物对52份山西省常引用和自选的糯玉米自交系进行了一致性检测，经大量、反复筛选，确定了山西省38份糯玉米自交系的DNA模板。然后用49对引物对6份标准测验种和38份玉米自交系进行扩增。从表1可以看出，本研究所选用的覆盖玉米全基因组的49对SSR引物在44份玉米自交系中均具有多态性，共检测到294个等位基因，不同SSR位点所检测到的等位基因为3～10个，平均每个位点6个。检测到等位基因最多（10个）的位点是umc2163，检测到等位基因最少（3个）的位点是phi076，umc1279，bnlg1940。44份玉米自交系的PIC平均为 0.633，变幅为 0.223～0.836。

表1 49对SSR引物在44份自交系中的等位变异情况及多态性信息量

特有基因指在标准种质中没有且只有1个 供试自交系有的等位基因；稀有基因是指在标准种质中没有且2个以上供试自交系有的等位基因。从表1还可以看出，共检测到稀有等位基因86个，特有等位基因32个。在phi080这个位点上存在稀有等位基因最多（5个），bnlg1450和umc1018位点上存在的特有等位基因较多，均为3个。表2统计的是糯玉米自交系材料中含有特有和稀有等位基因的数量。

从表2可以看出，朱子糯、罗糯米含有特有等位基因数分别为5，4个；山黑M，3B含有稀有等位基因分别为18，17个。这说明山西省糯玉米自交系中含有较多的稀有和特有等位基因。

表2 38份糯玉米自交系中特有和稀有等位基因数

2.2 聚类分析

根据SSR数据得出，38份糯玉米自交系的遗传相似系数在0.69～0.94之间。自交系丹340和 XN-1，05-34和 Mo17，05-774和 Mo17 之间的遗传相似系数较小，为0.69；自交系L2与L4间遗传相似系数为0.94，北珍和早M的遗传相似系数为0.93。以SSR标记遗传相似系数建立矩阵，利用ntsys-pc2.10e数据分析软件，用UPGMA进行聚类分析，建立树状聚类图（图1）。在遗传相似系数约为0.77时，44份自交系很明显被分为8大类群。

从表3可以看出，各类群包括的自交系主要是：第1类群为以黄早4为代表的含有唐四平头血缘的自交系，共6份；第2类群是山西群1，共1份；第3类群为以丹340为代表的旅大红骨群，共8份；第4类群是以Mo17为代表的Lancaster群；第5类群为山西群2，共23份；第6类群是以B73为代表的Reid群；第7类群为以掖478为代表的PA群，共3份；第8类群为齐319的PB群（表3）。从表3还可以看出，没有1份糯玉米自交系划分在Lancaster群、Reid群和PB群中。

表3 44份糯玉米自交系的SSR标记聚类结果

3 讨论

很多自交系虽然经过了多代选择，在形态上趋于一致，但在遗传上还存在异质性，严重影响统计数据的准确性。因此，本研究首先用20对标准引物进行试验材料的一致性检测，通过一致性检测可以有效地避免上述问题出现，减少数据误差。

糯玉米种质是受隐性突变基因（wxwx）控制的一个普通玉米突变类型。糯玉米种质与普通玉米的最大区别是糯与非糯的差异，即由该基因所控制的表型性状的差异，而该基因位于第9染色体上。结果表明，本研究选用的分布于玉米的整个基因组的49对SSR引物在普通玉米自交系与糯玉米自交系中均检测到等位变异的存在。这说明2类种质的遗传差异不仅仅是限于该糯性基因位点，而是遍布整个基因组的。这进一步证明了SSR标记是鉴定糯玉米种质资源亲缘关系的一条有效途径。

刘雪[11]将70对SSR引物在44份地方品种中检测到的等位基因数目和在12个标准自交系中检测到的等位基因进行比较，发现在每个群体中都有一些在标准自交系中未能检测到的稀有等位基因，在陕西省的白乌龙早群体中发现的稀有等位基因数最多（16个）。段运平等[12]在13份国内适应群体中发现，国内群体所特有的等位基因13个。本研究应用SSR技术分析山西省38份糯玉米自交系时发现，在每个材料上都能检测到很多稀有等位基因，总共检测出86个稀有等位基因；在16份材料中检测到特有等位基因，共检测出32个特有等位基因。这说明山西糯玉米自交系遗传多样性非常丰富，很多自交系具有频率很高的独特基因。可以初步认为，具有特异等位基因的这些自交系有可能作为山西省核心种质的标志，在一定程度上代表了山西糯玉米自交系的分子指纹特征。

所选用的 38份材料的遗传相似系数在0.69～0.94之间，说明多数材料间具有一定的遗传差异。山西糯玉米自交系分为5大类，其中，有2类明显与普通玉米的6大类群不在一类，以玉F为首的一类中含有丰富的山西省本地糯玉米资源，这就为育种者提供了新的育种方向，可以培育Lancaster群、Reid群和PB群的糯玉米自交系，也可通过本地类与其他玉米优势群系杂交培育新的杂交种。

综上所述，SSR分子标记技术是在DNA水平上明晰糯玉米种质遗传多样性水平，并对其进行遗传构成分析和类群划分的有效手段。山西省糯玉米自交系遗传多样性非常丰富，有许多特有的等位基因，它们可能具有一定的特异性，对于拓宽种质的遗传基础可能会起很大的作用，应引起育种家的高度重视。而且，很多山西省糯玉米自交系构成了独特的一个类群，有可能形成新的糯玉米杂优模式。

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