郭开峰 曾 云

1（自贡市第四人民医院 肿瘤科，自贡643000）

2（川北医学院 药理教研室，南充637007）

肿瘤研究者认为肿瘤内部含有一小部分具有自我更新、多向分化潜能的细胞，即肿瘤干细胞［1－3］。这小部分细胞是肿瘤发生、发展、复发、转移、耐药及放疗抵抗的根源［2－4］。因此，分离并对其生物学特性进行研究对肿瘤的诊断、治疗具有重要意义。本实验选取结肠癌细胞株CW－2为研究对象，应用无血清悬浮培养法初步获得肿瘤干细胞，并对其进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

人结肠癌细胞株CW－2购自中国科学院上海生命科学院细胞库；RPMI1640 和DMEM／F12 培养基购自Hyclone公司；胰酶购自Gibco公司；重组人表皮细胞生长因子（Recombinant Human Epidermal Growth Factor，EGF）、重组人白血病抑制因子（Recombinant Human Leukemia Inhibitory factor，LIF）、重组人碱性成纤维生长因子（Recombinant Human fibroblast growth factor－basic，bFGF）购自Sinobio公司；青霉素G、链霉素购自华北制药股份有限公司；Anti－CD44－FITC、Anti－EpCAM－PerCP－Cy5.5和其同型抗体购自BD Bioscience公司。

2 方法

2.1 CW－2细胞在含血清培养基（SSM）中常规培养

将CW－2细胞以105个／ml接种于含10%胎牛血清RPMI1640培养基中。在37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，2d换液。待细胞长满瓶底约80%时传代。

2.2 无血清悬浮培养富集CW－2干细胞

2.2.1 将在SSM 中处于对数增长期的细胞以105个／ml接种于无血清悬浮培养液（serum－free medium，SFM）中传代培养。前14d直接向培养瓶中加入培养液，14d后通过胰酶消化法和机械吹打法分离成单细胞悬液后传代。每天观察CW－2 细胞在SFM 中形成肿瘤干细胞球的过程。

2.2.2 向长满瓶底80%的SSM 培养细胞直接换液为SFM，在37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，2d换液，观察其生长情况。

2.3 流式细胞检测CD44、EPCAM 的表达

将含血清常规培养、无血清悬浮培养细胞球分别以106个／ml重悬于200μl PBS中，分别加入20 μl的Anti－CD 44－FITC和Anti－EPCAM－PerCP－Cy 5.5。……