谭之杨，张尚勇



用酿酒酵母测定直接耐晒宝石蓝的急性毒性

谭之杨，张尚勇*

（武汉纺织大学 纺织科学与工程学院，湖北 武汉 430073）

本文的目的是建立直接耐晒宝石蓝的急性毒性微量快速分析方法。通过用基于电阻法细胞计数原理的手持式细胞计数器测定由密度约为1.0×104细胞/ml的酿酒酵母悬液20 μl和系列浓度待测染料溶液130 μl与2.2倍YPD液体培养基110 μl所组成的体系在30℃、150 r/min恒温摇床上震荡培养6 h后的细胞数目，求算出该染料的EC50。结果显示直接耐晒宝石蓝对酿酒酵母的EC50为4995 mg/l，与文献报道的小鼠经口LC50=5 g/kg一致。表明本法可作为传统急性毒性测定的替代方法。

酿酒酵母；直接耐晒宝石蓝；急性毒性

直接染料对纤维有较强的亲和力，无须媒染剂就可以上染纤维素纤维，直接染料生产过程简单，使用方便，价格低廉，广泛应用于棉纤维染色，也可用于粘胶、真丝等纤维的染色以及制革、造纸等工业产品的染色。

多数直接染料的原料为芳香胺，芳香胺是一类致癌物质。因此，在德国首批禁用染料中，直接染料占了很大的比重，其中以联苯胺、二甲基联苯胺等三类衍生物作为中间体合成的直接染料占全部被禁用的直接染料的90%以上。

目前的直接染料检测方法中规定使用的主要仪器是气质联用仪，目前全部依靠进口，每台气质联用仪折合人民币在80万元左右，每台设备一天最多只能检验30份样品，同时在检测处理过程中要使用大量高纯度试剂和进口提取柱等材料，费用相当高。多数地市级检测机构都没有能力购置配备这一检测设备，也就无法开展相应的检验工作，这制约了我国直接染料检测的覆盖范围。

而传统的急性毒性测试一般需要设置5-7个剂量组，同时规定每个剂量组的小鼠、裸鼠或豚鼠的数目不少于10只；大鼠、新西兰兔的数目为6-8只；家兔、犬等的数目为4-6只，根据24 h的死亡率和14天内的总死亡数计算速死性化合物求其LD50(LC50)，并需要详细观察动物中毒症状的发生和发展过程，死前症状、死亡时间、体重变化、出汗流涎，血性分泌物、瞳孔改变、器官有无充血、出血、水肿或其它改变。

传统急性毒性测定过程的复杂性、高成本、高耗时以及残留的动物尸体对环境的二次污染等问题迫使人们尝试开发鱼类毒性测试、蚤类毒性测试、四膜虫毒性测试、藻类毒性测试、发光细菌毒性测试和生物传感器测试方法：

鱼类毒性测试方法：鱼类毒性实验采用24 h、48 h、96 h测定有毒物质的LC50，适用于水中单一物质的毒性测定，但静水法、换水法和流水法测定结果不一致，同时需要大量实验材料和多次重复实验[1]。

蚤类毒性测试方法：蚤类是国际上普遍采用的实验生物[2，3]。采用死亡率、捕食行为改变为指标。但标准不易统一。

四膜虫毒性测试方法：采用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)和流式细胞术联合检测四膜虫()的彗尾长度、拖尾率、细胞损伤率、DNA损伤以及DNA相对荧光强度，从DNA损伤角度探讨工业废水中常见的含氮杂环化合物对四膜虫的毒性作用[4]。但该法所测试的毒性种类有限，很难用于染料及其印染废水毒性测试。

藻类毒性测试方法：斜生栅藻、小球藻、盐泽螺旋藻、扁藻等的生长抑制为测试指标可测定被检测物的急性毒性，也有将细菌荧光酶基因转入丝状体固氮蓝藻-鱼腥藻中，利用其作为报告基因，通过对发光强度的测定来检测被测物的急性毒性[5]。但是工作量大，测定周期长，而且不适用于染料。

发光细菌毒性测试方法：美国Backman公司研制了一种商品名为Microtox的生物发光光度计(即生物毒性测定仪)[6]，其中明亮发光杆菌发光强度的变化检测污染物的毒性的灵敏度与鱼类96 h急性毒性实验相当。我国于1995年将这一方法列为水质急性毒性检测的标准方法。青海孤菌(sp. nov.)也用于淡水样品的生物毒性检测。硝化细菌也用于有毒物质的毒性检测。英国PPM公司研发了一种名为AMTOX的在线测试仪，该仪器基于固定化硝化细菌消耗样品中的氨，并通过测定底物中氨氮的消耗速率来检测样品的毒性。但是，发光细菌法检测毒性具有发光强度本底值差异较大，检测期间发光变化幅度宽的问题，所测得的数据不准确。同时，由于许多染料本身是荧光淬灭剂，不适于该法。

生物传感器测试方法：用于毒性检测的生物传感器有酶传感器[7]、微生物传感器[8]、DNA传感器[9]和免疫传感器[10]等。但是，酶、DNA和抗原-抗体的专一性强，因此，一种生物传感器只能特异地检测一种物质的毒性。

目前还没有建立适用于评价染料及其印染废水毒性的合适方法。因此，只有少数染料具有急性毒性LD50数据，绝大多数染料的毒性数据还是空白。开发可靠、方便、快捷的生物毒性检测方法成为当务之急。本文进行了直接耐晒翠蓝GB(又称锡利翠蓝GL、直接耐晒翠蓝GL、直接耐晒宝石蓝；Lionol Blue GB)的急性毒性测定。

1 材料与方法

1.1 制备酿酒酵母菌悬液

在超净工作台内，用无菌牙签收集平板培养酿酒酵母单菌落转入标号为①的已灭菌的Eppendorf管中，加入1000 μl无菌纯水混悬，取该混悬液200 μl加入1支5 ml无菌试管中，加入1.8 ml无菌纯净水，在分光光度计上测得OD600=0.248，得知①号管中悬液的细胞密度为0.248÷1.4×108×10=1.7714×108个/ml；从①管取56.4 μl入②管，加入944 μl无菌纯净水即成1×107个/ml的菌悬液；将②管中的菌悬液稀释1000倍，即配制成细胞密度约为1.0×104个/ml的菌悬液，放入4℃冰箱中备用。

1.2 配制直接耐晒翠蓝GB溶液

用电子天平称取60 mg直接耐晒翠蓝GB入5 ml连盖离心管中，加无菌纯水3 ml溶解，放入4℃冰箱中备用(染料储备液)；将编号为0#-11#和编号为0’#-11’#的1.5 ml无菌Eppendorf管，分两排放在5×16=80孔多功能彩色离心管架上，用单道可调20-300 μl量程移液器配合20-300 μl吸头分别取130 μl浓度为20000 mg/l的待测直接耐晒翠蓝GB溶液入11#、11’#和10#管；在10#管中加入无菌纯水260 μl，混匀后；从10#管分别取130 μl混合液入10’#和9#管，并加入无菌纯水260 μl，然后混匀，依次配制8#-1#、9’#-1’#管溶液，从1#、1’#管用移液器取出130 μl混合液弃去；得到20000、6667、2222、741、247、82.3、27.4、9.14、3.05、1.02、0.34 mg/l共11种浓度的直接耐晒翠蓝GB待测溶液共2组。

1.3 培养细胞

将上述24支Eppendorf管放在冰浴中，0#和0’#管则加入130 μl无菌纯净水，所有管中均加入2.2倍YPD液体培养基110 μl和20 μl细胞密度为3.0×105个/ml的菌悬液；盖好管盖，在30℃、150 r/min恒温摇床上振荡培养7.5小时。

1.4 洗涤细胞

取出各离心管放入小型高速离心机中，用4000 r/min离心10 min，弃上清液；用12道可调20-300 μl量程移液器加入PBS(pH 7.4)缓冲液300 μl洗涤各离心管中的细胞团2次。

1.5 计数悬液制备

将各洗涤后的细胞团分别用PBS(pH 7.4)缓冲液配制成240 μl菌悬液。

1.6 测定细胞数目

用电阻法细胞计数原理的手持式细胞计数器测定菌悬液的细胞浓度。

1.7 求算染料EC50范围

将所测得的各管菌悬液的细胞浓度减去初始细胞浓度，除以对照管菌悬液的细胞浓度，定义为细胞分裂率；将相同浓度染料的细胞分裂率平均，将染料浓度除以2所得数值为横坐标、平均细胞分裂率为纵坐标绘图，得到一条曲线，通过纵坐标上的一点(0,50)作X轴的平行线，交曲线于A点，过A点作Y轴的平行线，交X轴于B点，B点的横坐标数值即为所求染料的EC50范围。

1.8 测定和求算染料EC50

重复步骤1.2至步骤1.7，但步骤1.2中的梯度稀释系数需根据染料EC50范围重新确定，分别将a取整，得到L’和H’，以L’和H’为再次测定过程中的染料溶液的浓度范围。B1点的横坐标数值即为所求染料的EC50­粗略值，将B1上下两个浓度值分布记为L1和H1，将线段L1H1分成10等份，观察B1对应的小刻度数值，并记为b；然后根据公式(H1- L1)÷10×b计算出EC50值。

2 结果与分析

2.1 不同浓度直接耐晒翠蓝GB对酿酒酵母细胞增殖的影响（见表1）

表1 直接耐晒翠蓝GB对酿酒酵母细胞增殖的影响

2.2 染料EC50范围为3333~10000 mg/l（见图1）

图1 直接耐晒翠蓝GB对酿酒酵母分裂的影响

图2 EC50范围直接耐晒翠蓝GB对酿酒酵母分裂的影响

2.3 染料EC50值为4995 mg/l

即L1=4400，H1=5100，将线段L1H1分成10等份，可见B1对应的小刻度数值约为b=8.5，EC50=(H1-L1)÷10×b=(5100-4400)÷10×8.5=4995 mg/l，见图2、图3。

图3 直接耐晒翠蓝GB的EC50的求算示意图(局部放大)

3 讨论

计算出EC50=4995 mg/l。与文献报道的小鼠口经LC50=5 g/kg一致。

和现有的方法相比，本方法具有如下主要优点：

微量：消耗的待测染料低于60 mg，特别适用于纺织品上染料的急性毒性测试。

快速：测定一种物质的大致EC50­范围的时间不超过8 h，一人在一天内可测试上百种物质；测定一种物质的EC50由一人在一天内可完成。

低耗：测定1种样品消耗：1只25 ml无菌试管，折合人民币0.1元；54只20-300μl 标准吸头，折合人民币5.94元；55只1.5 ml连盖离心管，折合人民币2.2元；YEPD液体培养基5.5 ml，折合人民币0.03元；PBS(pH 7.4)缓冲液42.3 ml，折合人民币0.04元；Scepter传感器24片，折合人民币48元；电费4.00元；合计60.3元人民币。如果同时测定几种物质，则测定费用更低。

方便：只需要超净工作台、高压灭菌锅、恒温摇床、离心机、电阻法手持式细胞计数器即可方便地开展工作，全部设备总价值最低可达4万元人民币以下。

通用：适用于各种在水中有一定溶解度的物质的急性毒性测试。

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[5] ISO20079 Water quality - Determination of the toxic effect of water constituents and waste water on duckweed ()-Duckweed growth inhibition test [S].

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Determination of the Acute Toxicity for Direct Fast Turquoise Blue GL by Saccharomyces Cerevisiae Meyen ex Hansen

TAN Zhi-yang, ZHANG Shang-yong

(College of Textile, Wuhan Textile University, Wuhan Hubei 430073, China)

This study was aimed to establish a quick acute toxicity analysis for Direct Fast Turquoise Blue GL (DFTB). Yeast (Saccharomyces cerevisiae Meyen ex Hansen) cell suspension which density was about 1.0×104cells/ml was preparation. Then a series of concentrations of the dye solution was preparation. The suspension systems were composed of 20 μl of the yeast suspension, 130 μl of the series of concentrations dye solution and 110 μl of 2.2-fold YPD liquid medium. Yeast cells were grown in the suspension system on a shaker with 150 rpm at 30°C. After incubated for 6 h, cell numbers were counted with a hand-held cell counter (Millipore Scepter). EC50was calculated. The results suggest that the EC50of DFTB was 4995 mg/l and the results were satisfactory. Conclusion: This method can be used as an alternative to the traditional LD50to acute toxicity determined in mice.

Saccharomyces Cerevisiae; Direct Fast Turquoise Blue GL; Acute Toxicity

X502

A

1009－5160(2012)03－0056－04

国家自然科学基金资助项目（50978208).

*通讯作者：张尚勇（1967-），男，博士，教授，研究方向：纺织科学与工程.