徐 洋，蔺凌云，尹文林，袁雪梅，潘晓艺，郝贵杰，沈锦玉

（浙江省淡水水产研究所，浙江湖州 313001）

随着中华鳖养殖规模逐年扩大，其养殖地位得到了稳固。然而中华鳖养殖业快速发展的同时也大幅提高了饲养密度，大大增加了疾病的发生率，给中华鳖的养殖户、甚至整个产业链都造成了巨大的经济损失。科研工作者及养殖业者日益重视这一现状，寻求行之有效防治措施迫在眉捷。据文献报道[1-2]，甲鱼病害达30多种，有肠道出血性败血症、鳖穿孔病（疖疮病）、红脖子红底板病、鳖腐皮病等，而细菌是其主要病原。本实验室从患肠道出血性败血症、鳖穿孔病（疖疮病）、红脖子红底板病、鳖腐皮病的中华鳖上分离到温和气单胞菌Aeromonas sobria[3]。目前我国对细菌性疾病的防治主要还是采用药物防治，效果不甚理想，往往还因为滥用药物，造成耐药性菌株出现、污染环境、甚至威胁到人类的食品安全。而免疫预防可以规避这些弊端，因此开辟中华鳖免疫防治是一条行之有效的途经。国内外开展鱼用疫苗的研究已有一段时期，并且也取得了很多不菲的成绩，但是针对鳖用疫苗的研究却甚少[4-6]。鉴于此近年来课题组一直围绕中华鳖免疫预防开展相关的研究，研制了鳖用四价细菌灭活疫苗，制备了针对中华鳖免疫球蛋白IgM单克隆抗体，建立了以单抗介导的TAS-ELISA[7-8]的疫苗免疫效果评价方法并且开展了四价疫苗免疫预防试验，取得了较好的结果，有效地抑制中华鳖的主要病害频发，促进养殖鳖业健康、稳定发展。现将所研究的部分内容汇报如下。

1 材料与方法

1.1 材料和来源

1.1.1 菌株来源

本实验室分离到4株不同血清型的温和气单胞菌分别为：分离自患典型肠出血败血症病甲鱼的病原菌TK961010、分离自患穿孔病甲鱼的病原菌TL970424、分离自患红脖子、红底板病甲鱼的病原菌TK970409以及分离自患腐皮病甲鱼的病原菌TL970528。

1.1.2 实验动物

健康中华鳖购自杭州市余杭区某养殖场，体质量为100～150 g/只；ICR小鼠及6～8周龄BALB/c小鼠购于浙江大学实验动物中心。

1.1.3 细胞

小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0由扬州大学农业部重点实验室惠赠。

1.2 四价菌苗的制备

1.2.1 细菌灭活

4株温和气单胞菌分别在营养肉汤及改良营养肉汤培养基，120 r/min摇床28～30℃培养20～24 h。将4株菌配制相同浓度（6×109CFU/mL）分别用不同浓度福尔马林进行灭活试验（最终浓度0.05%～5.0%），温度为4℃、30℃、63℃，定时取出灭活的菌样，无菌条件下离心去上清，再加入等量生理盐水，取0.5 mL涂平板，培养3 d，检验灭活效果。

1.2.2 菌苗制备

经灭活的4株菌，6 000 r/min离心30 min，用无菌生理盐水洗涤3次，制成总含菌量为6×109CFU/mL的四价全菌苗。选择蜂胶作为免疫佐剂，经过适当处理，取适量与四价全菌苗完全混匀乳化，置4℃冰箱贮存备用。

1．2．3 无菌检验与安全性检验

取四价菌苗0．2 mL接种于肉汤培养基，30℃培养4 d，观察有无细菌生长。将2倍使用浓度的疫苗腹腔注射小白鼠及中华鳖各5只，观察存活情况。

1．3 单克隆抗体的制备

1．3．1 抗原制备

取健康中华鳖，断颈取血，室温下凝固，置4℃过夜，2 000 r/min离心取其上清。血清经50%饱和浓度的硫酸铵沉淀并透析浓缩，用 PBS（pH 7．4）进行倍比稀释，经 0．45 μm 滤膜过滤后 SephadexG－200 层析[9]。自动收集洗脱液，最先洗脱的蛋白即为IgM。测定所收集的IgM浓度并置于－20℃冰箱保存备用。

1．3．2 小鼠免疫

参照文献[10－11]，取适量的抗原与等体积弗氏完全（不完全）佐剂充分乳化处理后，皮下多点注射BALB/c小鼠，抗原的蛋白量为100 μg/只，首免后第14和21天各加强免疫1次，融合前3天腹腔加强免疫1次。

1．3．3 细胞融合

细胞融合参照文献[12－13]进行，将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞混合于融合管内，利用PEG4000处理达到融合，将融合后的细胞分装至装有饲养细胞的96孔板，放于6%CO2培养箱内培养。

1．3．4 阳性克隆的筛选、定株及腹水制备

融合后1周即可取培养上清进行间接ELISA法检测；将阳性孔中的细胞按有限稀释法进行亚克隆，至阳性率为100%时，即可定株并冻存；同时按Golding方法[14]制备腹水。

1．4 TAS－ELISA 方法的建立

将四价菌苗包被于4℃冰箱过夜；用PBST充分洗涤3～4次，用封闭液，37℃封闭3 h，如上洗涤；加入中华鳖抗血清(从1:200开始作倍比稀释)，37℃孵育1．5 h，如上洗涤；加入工作浓度（1:1 000）稀释的中华鳖IgM单抗腹水，37℃孵育1．5 h，如上洗涤；加入工作浓度(1:1 000)羊抗鼠IgG酶标抗体，37℃孵育1．5 h，如上洗涤；加入OPD避光显色，用2 mol/L硫酸终止反应。用酶联免疫阅读仪读出OD490值。若P/N≥2．1者则判为阳性，而P/N＜2．1者则判为阴性（P为TAS－ELISA所测免疫组血清中抗体的OD值；N未所测对照组血清中抗体的OD值）。

1．5 免疫效果的研究

1．5．1 中华鳖免疫试验

选择幼鳖转池或出温室季节，免疫50只体质量为100～150 g/只的健康中华鳖，后腿肌注，免疫剂量为0．2 mL/只，此为免疫组；并设置对照组，后腿肌注等量的生理盐水，接种20只体质量为100～150 g/只的健康中华鳖。

1．5．2 免疫效果的评价

中华鳖按1．5．1方法免疫后，在60 d内，从0 d起每隔10 d，设一个时间点；在60～100 d内，从60 d期每隔20 d，设一个时间点，在所设的时间点随机采集3只免疫组和1只对照组的中华鳖的血清，用1．4所建立的TAS－ELISA方法测血清中抗体效价。

1．5．3 免疫保护率的测定

中华鳖受免40 d时，分别用4株不同血清型的温和气单胞菌进行攻毒实验，菌液浓度为5LD50（1×108CFU/mL），每组选4只免疫组的中华鳖，注射剂量为0．5 mL/只，鳖后腿肌注，水温为26～29℃，饲养30 d，同时设立对照组，注射相同剂量的无菌生理盐水。免疫保护率＝(1－免疫组死亡率／对照组死亡率)×100%。

1．5．4 免疫推广试验

推广试验选取2个试验点，分别为湖州中湖农业生态发展有限公司即试验点1与浙江清溪鳖业有限公司即试验点2。

1．5．4 ．1 试验点 1 的免疫推广情况

该试验点设置免疫池和对照池。免疫池投放中华鳖7 000只，体质量为150～200 g/只，每只后腿肌注0.2～0.3 mL疫苗；其余未进行免疫注射的为对照池。免疫40 d时分别从免疫池和对照池中随机各取3只中华鳖采血，测定其血清中的ELISA抗体效价。并在出售时计算其成活率及产量等情况。

1.5.4 .2试验点2的免疫推广情况

该试验点设置免疫池和对照池。免疫池投放中华鳖4 400只，体质量为100～150 g/只，每只后腿肌注0.2～0.3 mL疫苗；其余未进行免疫注射的为对照池。免疫40 d时分别从免疫池和对照池中随机各取3只中华鳖采血，测定其血清中的ELISA抗体效价。并在出售时计算其成活率及产量等情况。

2 结果

2.1 培养基的改良

经相同条件培养，同一菌株在常规营养肉汤培养基中培养菌浓度为2×109CFU/mL，而用改良营养肉汤培养基中培养菌浓度为6×109CFU/mL，后者菌浓度比前者提高了3倍。

2.2 灭活条件的优化

在不同的温度下，选择不同浓度的福尔马林及不同的灭活时间灭活4株温和气单胞菌，当灭活温度设为4℃和30℃时，4株温和气单胞菌在3.5%福尔马林溶液中，24 h全部灭活；当温度为63℃时，4株温和气单胞菌在0.5%福尔马林溶液中，1.5 h全部灭活。

2.3 疫苗的无菌检验与安全性检验

取0.2 mL菌苗接种于肉汤培养基，30℃培养4 d，无菌生长。将两倍使用浓度的疫苗腹腔注射小白鼠及中华鳖各5只，观察15 d，无一死亡，接种部位未见溃烂、结节。

2.4 单抗的筛选

采用1.3的方法，共获得了3株对中华鳖免疫球蛋白IgM的特异性单抗细胞株，分别命名为4F2、3H3、3B7，其培养上清效价分别为1:3 200、1:6 400和1:3 200。将3H3制备小鼠腹水，其ELISA效价为1:51 2000。

2.5 免疫效果的研究

2.5.1 免疫效果的评价

将1.4中建立的TAS-ELISA方法用于测定中华鳖免疫后不同时间段内血清中的抗体效价，结果见表1。从表1中可知免疫后10 d就可测到抗体效价，当40 d时抗体产生达到高峰，50 d后抗体效价开始下降，到100 d时中华鳖处于冬眠状态，抗体产生很少，仅测到较低的效价。

表1 中华鳖免疫后血清中抗体效价Tab.1 The antibody titers in serum of turtles after immunization by TAS-ELISA for different time

2.5.2 免疫保护率的测定

按1.5.3中方法进行鳖免疫保护率的测定，攻毒后饲养1个月，结果显示免疫组的死亡率为0，而对照组死亡率为100%。对照公式：免疫保护率＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100%进行计算，可知鳖经四价苗免疫40 d，免疫保护率为100%。

2.5.3 免疫推广试验

试验点1：免疫池的鳖40 d后取样，测定其血清中的抗体ELISA效价，结果见表2。结果显示：免疫后40 d的鳖产生较高抗体效价达1:(3.2×103)～1:(1.28×104)；对照池的鳖血清中对所测细菌仅有较低效价；至出售时统计，免疫池的鳖成活率为95%，对照池的鳖成活率为90%。试验点2：免疫池的鳖40 d后取样，测定其血清中的抗体ELISA效价，结果见表2。结果显示免疫后40 d的鳖产生较高抗体效价达1:(3.2×103)～1:(6.4×103)；对照池的鳖血清中对所测细菌仅有较低效价；至出售时统计，免疫鳖成活率为89%，未免疫池鳖成活率为85%。

表2 鳖免疫后血清中抗体ELISA效价Tab.2 The antibody titers in serum of turtle after immunization by TAS-ELISA for 40 days

3 讨论

鳖属于脊椎动物爬行类龟鳖目，介于鱼类与哺乳类之间。鳖的基本免疫器官和细胞为胸腺、脾脏、淋巴组织及淋巴细胞、浆细胞和粒细胞等[15]，具有非特异性免疫应答和特异性免疫应答。国外多位学者CHARTRAND、GREY、MAUNG、LESLIE和CLEM等利用不同抗原对龟鳖类进行刺激，均产生了较强的体液免疫反应，说明了特异性免疫在鳖类免疫中具相当重要作用[16-19]。在特异性免疫中人工主动免疫的特异性免疫力持续时间长，接种疫苗就是一种人工主动免疫，而在种类繁多的疫苗制品中灭活疫苗凭借其可靠的安全性和制品的稳定性一直受大众青睐。近年来不断暴发的中华鳖细菌性疾病，让养殖业者苦不堪言，为了解决困扰养殖户的难题，本研究开展了细菌灭活疫苗的研制，将分离自中华鳖主要细菌性疾病的4株病原菌灭活后添加蜂胶佐剂，制成四价菌苗。在灭活菌苗制备初期，就确定灭活剂（福尔马林）的浓度，灭活的温度及灭活时间,课题组开展了大量的摸索性试验并与鱼类败血症嗜水气单胞菌疫苗制备时的相应条件进行了比较，结果显示两者相差甚远[6]。

为了验证该疫苗的免疫效果，课题组建立了由单抗介导的TAS-ELISA检测方法，利用此方法能够十分直观的通过效价来判断免疫效果。本方法与之前的凝集法测抗体相比较，其优势在于大大提高了灵敏性和特异性，为鳖用疫苗的大规模应用、免疫效果的追踪以及研究鳖的体液免疫应答奠定了良好的基础。

课题组所研制的四价菌苗进行了小规模鳖的免疫预防研究，结果表明：利用所建立的单抗介导的TAS-ELISA进行体液免疫追踪，鳖在免疫后10 d测到抗体，其效价随着免疫时间升高，当40 d时抗体达到最高峰，50 d后抗体的效价开始下降，到100 d时效价已降到极低，这与简纪常、MAUNG等[18,20]的报道相一致，不同之处在于简纪常等是用凝集法测抗体。7-9月首次免疫后的第40天，对中华鳖进行2次免疫，却未发现抗体效价升高，其原因可能是中华鳖本身缺乏2次免疫应答能力，或是其2次免疫应答出现的时间间隔较长，以至未见抗体水平升高，抑或是饲养在水族箱中，受外界环境及饲养条件的限制，使抗体合成能力有所下降。考虑到今后在生产实际中的应用，放养后的幼鳖再进行2免的可行性不大，而且在首次免疫后，有效抗体维持的时间足以保障中华鳖度过病害发生的危险期，11月之后，鳖开始进入冬眠状态，抗体产生会很少，同时常见病害也不易发生。生产性试验证明幼鳖首次注射免疫鳖用四价疫苗后，可在病害高发期有效地保护鳖免受四种常见致病菌感染，免疫后其成活率有较大辐度地提高。这说明注射此四价菌苗可使鳖获得较强的抵抗力，达到预防疾病的目的。此疫苗在中华鳖养殖业中具有广泛的应用前景，将成为防控疾病发生和流行的重要手段。

[1]吴惠仙.中华鳖常见细菌病的病原鉴定及药物体外拮抗比较[J].水产科学,2004,23(6):5-9.

[2]马有智,舒妙安.中华鳖温和气单胞菌病的病原研究[J].浙江大学学报:理学版,2000,27(3):329-333.

[3]沈锦玉,尹文林,钱 冬,等.养殖鳖主要细菌性疾病病原的初步研究[J].浙江海洋学院学报:自然科学版,1999,28(1):29-33.

[4]杨广智,张念慈.草鱼出血病细胞疫苗的制备方法及其免疫效果的初步研究[J].鱼病简讯,1986(2):9-11.

[5]杨先乐,夏 春,左文功.草鱼出血病细胞培养灭活疫苗的研究[J].水产学报,1989,13(2):138-144.

[6]陈月英,钱 冬,沈智华,等.养殖鱼类细菌性败血症的菌苗制备技术[J].水产学报,1996,20(2):125-131.

[7]SIWICKI A K,VERGNET C,CHARLEMAGNE J,et al.Monoclonal antibodies against goldfish(Carassius auratm)immunoglobulin:application to the quantification of immunoglobulin and antibody-secreting cells by ELISPOT and saris immunoglobulin and antibody levels by ELISA in carp[J].Vet Res,1994,25:458-467.

[8]AUSTIN B.Monoclonal antibody-based enzyme-linked immunsorbent assays for the rapid diagnosis of chnical cases of enter red-mouth furunculosis in fish farms[J].J Fish Dis,1986(9):469-474.

[9]钱建飞.鸡IgM单克隆抗体研究I．亲和层析纯化鸡IgM[J].江苏农业学报,1994,10(2):33-37.

[10]杨廷彬,尹学念.实用免疫学[M].长春:长春出版杜,1994:60.

[11]JOHNSTONE A,THORPE R.实用免疫化学[M].童明庆,孙南雄,译.南京：南京出版社,1990:68-69.

[12]林灭龙.欧洲鳗免疫球蛋白单克隆抗体的制备与特性[J].水产学报,2001,6(6):532-537.

[13]刘秀梵.单克隆抗体在农业上的应用[M].合肥:安徽科学技术出版社,1994:56-89.

[14]GOLDING J W.Monoclonal antibodies:principle and practice[M].New York:Academic press,1983:131-135.

[15]杨廷彬,尹学念.实用免疫学[M].长春:长春出版社,1994:401-407.

[16]CHARTRAND S L.The evolution of the immune response-The immunoglobulins of the turtle[J].J Immunol,1971,107:1-11.

[17]GREY H M.Phylogeny of the immune response studies on some physical,chemical and serological characteristics of antibody production in turtle[J].J Immunol,1963,91:819-825.

[18]MAUNG H T.Immunity in the tortoise,Testudo ibera[J].J Pathol Bacteriol,1963,85:51-66.

[19]LESLIE G A,CLEM L W.Phylogeny of immunoglobulin structure and function.-17s,7.5s and 5.7s anti-DNI’of the turtle[J].J Immunol,1972,108:1 656-1 661.

[20]简纪常,吴婷婷,杨 弘,等.中华鳖体液免疫应答的初步研究[J].中国水产科学,1998,5(4):6-10.