林建安，叶建新，杨树钢

(福建医科大学附属第一医院胃肠外科，福建福州350005)

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是cerb-B1基因编码的Src族跨膜受体，酪氨酸激酶是细胞外信号传递到细胞内的重要枢纽［1－2］，在肿瘤发展过程中起重要作用，是治疗肿瘤的理想靶点，其靶向药物西妥昔单抗已经应用于临床且取得了良好的效果，但目前处于平台期;RNA干扰技术是将与信使RNA(mRNA)对应的外源性小片段RNA导入细胞，与该片段siRNA同源的mRNA发生特异性降解，导致其相应的基因受到抑制的技术，在剔除目标基因上具有特异性、稳定性及高效性等优势，正成为包括结肠癌在内各种肿瘤基因治疗研究中的热点［3］。本研究利用siRNA方法抑制人结肠癌SW480细胞EGFR基因的表达，并观察受抑制后人结肠癌SW480细胞体外生长情况的改变。

1 材料与方法

1.1 材料 人结肠癌细胞株SW480购于中国典型培养物保藏中心，RPMI-1640培养基和小牛血清购自GIBCO公司，EGFR抗体购自Santa公司，转染试剂LipofectamineTM2000和青霉素－链霉素液体购自Invitrogen公司，MTT购自Sigama公司，荧光定量RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司，细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。EGFR-siRNA由上海吉玛制药有限公司合成。EGFR-siRNA干扰序列见表1。

表1 EGFR-siRNA干扰序列

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用含体积分数10%小牛血清的RPMI-1640培养基培养，细胞为贴壁生长细胞。细胞传代时用质量分数0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1∶2或1∶3传代，加入培养液后在37℃，体积分数5%的CO2孵箱中培养。

1.2.2 转染 转染前一天收集3～5×105细胞接种在6孔板上，2 mL含 小牛血清的RPMI-1640细胞培养基，将稀释好的siRNA和RNAi-Mate试剂混合;轻柔混匀，室温放置 20 min，以便形成 siRNA/lipofectamin复合物。将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞2遍后，加入2 mL无血清培养基，将500 μL siRNA/lipofectamin复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻摇细胞培养板，孵育4～6 h后，除去复合物，更换培养基，细胞继续在CO2培养箱中37℃温育24～48 h后，进行转染后的其他检测步骤。

1.2.3 荧光定量 RT-PCR TRIZOL法提取细胞总RNA，反转录为cDNA，应用Primer5.0设计引物扩增EGFR基因，上游引物 5'-GAGTTAAGATTTTTTTAAGGGTCCC-3'，下游引物 5'-TAACTGACATGGGTCGGCC-3'，内参基因 β actin，上游引物5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物 5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，反应体系为 SYBRⓇPremix Ex TaqTM(2 ×)10.0 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L－1)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L－1)0.4 μL，ROX Reference Dye(50 ×)0.4 μL，DNA 模板2.0 μL，ddH2O(灭菌蒸馏水)6.8 μL，Total 20 μL;反应条件为95℃、30 s然后 95 ℃、5 s，57 ℃、30 s。本实验采用ABI step one PCR仪(美国生物应用公司产品)。每组实验重复3次，RT-PCR结果根据靶基因的相对定量按公式得出，靶基因相对表达量 =2－△△Ct。其中△△Ct=(△Ct，Q － △Ct，C)。△Ct，Q 为实验组靶基因的Ct值与管家基因Ct值之差;△Ct，C为对照组靶基因的Ct值与管家基因Ct值之差［4］。

1.2.4 Western blot法 提取待测细胞蛋白进行定量，将样品调成相同浓度，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜上，将膜置于封闭液中于4℃封闭过夜以除去非特异的结合位点，然后一抗孵育，用含1×TBS，洗膜3次，再与二抗孵育，同上洗膜3次。将膜与CDP-Star作为碱性磷酸酶的化学发光底物，与膜室温下孵育反应5 min后，暗室中X光片曝光、显影。运用图像分析软件Qone对Western blot结果进行分析，以蛋白条带的灰度扫描比值来表示蛋白的相对表达水平及统计分析。

1.2.5 细胞生长增殖抑制率 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法，待测细胞经胰酶消化后，调节细胞浓度约为5.0～10×104·mL－1;以每 5.0 ～1.0 ×103个细胞接种于4个96孔培养板中，每孔体积100 μL。设6个复孔，分别培养12、24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g·L－1)，继续培养 4 h，加 200 mL DMSO，放置水平摇床15 min后，在490 nm处测定吸光度(A)。细胞生长抑制率=(对照组－处理组)/(对照组－本底)×100%

1.2.6 细胞凋亡检测 贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集;用PBS洗涤细胞2次(2 000 r·min－1离心5 min)收集1～5×105细胞;加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞;加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入 5 μL Propidium Iodide，混匀;室温、避光、反应5～15 min;在1 h内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。用流式细胞仪检测，激发波长=488 nm;发射波长=530 nm。Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道检测;PI红色荧光通过PI通道检测。

1.3 统计学处理 运用SPSS 13.0进行统计分析，计量资料以±s表示，比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 EGFR基因的表达 通过引物溶解曲线分析，EGFR基因扩增成功，实验所获得数据采用比较CT值法(2－△△t法)进行相对定量分析，实验结果示:EGFR395-siRNA和EGFR1499-siRNA对SW480细胞的mRNA表达与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 2、图1。

表2 RT-PCR检测各处理组靶基因抑制情况

2.2 EGFR蛋白的表达 EGFR395-siRNA对EGFR蛋白表达较对照组有显著性抑制作用(P＜0.05)，EGFR395-siRNA对EGFR的表达较对照组抑制比较差别有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

结果显示，SW480细胞中的EGFR蛋白在EGFR-395和 EGFR1499-siRNA组的表达下调，EGFR-1211 siRNA和脂质体组、NC组、对照组的表达比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。

2.3 细胞增殖抑制率 不同处理之后，EGFR395-siRNA和EGFR1499-siRNA作用于SW480细胞48 h后与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，但由于时间延长，本实验为瞬转，siRNA脱靶效应，抑制率逐渐下降。见图3。

2.4 EGFR-siRNA作用后细胞凋亡率 转染后各组细胞凋亡率分别为对照组(3.2±0.7)%，EGFR395-siRNA 组(15.8 ±1.2)%，EGFR1211 组(9.5 ±2.1)%，EGFR1499-siRNA 组(14.1 ± 1.7)%;EGFR395-siRNA和EGFR1499-siRNA组较对照组凋亡率均高，比较差异均有统计学意义(P均 ＜0.05)。见图4。

3 讨论

EGFR在很多肿瘤组织中过表达。有研究［5］表明70%以上的结肠癌组织中有EGFR高水平表达，EGFR高表达或活性增强与肿瘤增殖、侵袭、转移、抗凋亡及放化疗敏感度下降等许多特性有关，因此研究 EGFR及针对EGFR的治疗，成为近年来抗肿瘤治疗的热点。

RNA干扰是近年发展起来的沉默基因的新技术，其是指由双链RNA引发的转录后基因沉默机制，通过具有序列特异性的双链RNA或shRNA与靶基因mRNA结合而导致目的基因表达下调，RNA干扰具有高稳定性，高效性，高特异性等特点，目前RNA干扰在癌基因组功能研究和肿瘤基因治疗中已显示出效果。

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，近年来，随着人民生活水平的不断提高，饮食习惯和饮食结构的改变以及人口老龄化，我国结肠癌的发病率和死亡率均保持上升的趋势［6］。EGFR的研究已经取得重大突破，其靶向药物西妥昔单抗已经应用于临床且取得良好的效果，但目前处于平台期。由于肿瘤基因治疗较少涉及伦理问题，加之临床治疗的迫切需要，肿瘤发生的分子机制及其基因治疗也已走在基因治疗的前列。

本实验是EGFR与RNA干扰技术相结合，探索RNA干扰EGFR的mRNA后对SW480细胞的体外干扰情况的研究，通过RT-PCR、Western blot法检测到EGFR基因的mRNA和蛋白的表达明显抑制，证实序列特异性的EGFR-siRNA能显著抑制EGFR基因的表达，并通过MTT和流式细胞学检测细胞增殖与凋亡，表明siRNA可以抑制 SW480细胞的增殖，并促进SW480细胞凋亡。本文结果显示，以EGFR为靶点的RNA干扰能明显抑制 SW480细胞中EGFR基因的表达，调控细胞周期，促进细胞凋亡，为结肠癌的基因沉默疗法提供了新的思路，更为以 EGFR基因为靶基因的RNA干扰技术由基础到临床的应用提供理论依据。

［1］Su LK，Johnson KA，Smith KJ，et al.Association between wild type and mutant APC gene products［J］.Cancer Res，1993，53(12):2728－2731.

［2］Nicholson RI，Gee JM，Harper ME.EGFR and cancer prognosis［J］.Eur J Cancer，2001，37 Suppl 4:S9 － S15.

［3］冯作化，药立波，周春燕，等.医学分子生物学［M］.北京:人民卫生出版社，2007:172，314

［4］Higuchi R，Fockler C，Dollinger G，et al.Kinetic PCR analysis:real-time monitoring of DNA amplification reactions［J］.Biotechnology(NY)，1993，11(9):1026 －1030.

［5］Wu X，Deng Y，Wang G，et al.Combining siRNAs at two different sites in the EGFR to suppress its expression，induce apoptosis，and enhance 5-fluorouracil sensitivity of colon cancer cells［J］.J Surg Res，2007，138(1):56 －63.

［6］曾益新.肿瘤学［M］.2版.北京:人民卫生出版社，2003:536－559.