边 颖，王金春，商艳君

激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-kinin system，KKS)在人体内分布较广，可协调机体内多种功能，如稳定血压、协调内环境、抑制炎性反应及促进血管再生等［1］。中枢神经系统的功能稳定依赖KKS的调控［2］。本实验通过观察大鼠的神经功能恢复情况，用免疫组化染色的方法测定神经生长因子(NGF)的表达，以证明其对中枢神经系统损伤修复的作用可能与NGF等神经营养因子有关，为进一步临床治疗提供实验依据。

1 实验方法

1.1 实验动物及分组 Wistar大鼠36只，由中国医科大学实验动物中心提供，体质量270～300 g。将36只动物随机分为3组。空白对照组:改良的Longa［3］栓线法制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞(MCAO)模型;盐水对照组(NS组):大脑中动脉闭塞后8 h，腹腔注射 NS 2 mL/(kg·d);TK治疗组(TK组):右侧大脑中动脉闭塞后8 h，腹腔注射TK 1 715 ×10-3U/(kg·d)。

1.2 MCAO模型的制作 取成年Wistar大鼠，体质量270～300 g。10%水合氯醛0.35 g/kg，腹腔注射麻醉。小心剥离右侧迷走神经与颈总动脉，结扎颈外与颈总动脉，夹闭颈总动脉远端，用针头在近结扎线处刺入颈总动脉，将直径为0.26 mm的鱼线插入颈总动脉，前行入颈内动脉，距颈内、颈外动脉分叉处约1.8～2.0 cm感到有阻力时停止，即大脑中动脉区。1 h后去除栓塞线。大鼠苏醒后，若有追尾现象，原地转圈，且向左侧倾倒，右侧Horner征，左前肢屈曲等即表明梗死模型成功。注意鱼线不能插入过深，否则易致蛛网膜下腔出血。

2 检测指标及方法

2.1 神经功能缺失评分 实验前先对大鼠进行训练，采用神经损伤评分［4］(NSS)。术后第1天，NSS 8～12分的大鼠进入本实验。术后第1、3、7天，对3组大鼠进行评分及方差分析。

2.2 脑梗死体积测定 将大脑由额极至枕极分为5枚脑片，2 mm/片，立即置于2%TTC(红四氮唑)溶液中，37℃水浴30 min，4%多聚甲醛固定30 min。显微图像分析系统采集每片脑切片上、下面图像，分析每片脑切片上、下面脑梗死面积。根据梯形法则计算脑梗死体积。

2.3 免疫组化染色 梗死后3d，将大鼠用10%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛心内灌注后取脑，固定24 h，组织脱水包埋。在梗死灶中心部位，相当于以前囟为中心，冠状面 +1～-1 mm，每隔100 μm，连续7 μm 切片5张，对NGF进行免疫组化染色。一抗为兔抗NGF(1∶200)，二抗为生物素化羊抗兔IgG。显色底物为DAB显色剂。

2.4 NGF测定 将染色后的脑组织切片取梗死周围皮质，进行显微图像采集、分析(Meta Morph/DP10/BX41)，记录经过处理软件包量化后的灰度值。2.5 统计学方法 用SPSS11.0统计软件做方差分析。数据以均数±标准差()表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 NSS评分 3组神经功能缺损减轻。TK组第3天NSS评分与其他2组的差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 各组NSS评分()

表1 各组NSS评分()

注:*与TK组比较，P＜0.05;#与NS组比较，P＞0.05

组别 第1天 第3天 第7天空白对照组 9 8.90±1.12*#9 4.30±0.55 6.48±0.79 7.98±1.23 NS组 9 8.50±0.71* 7.56±0.85 TK组

3.2 动物模型经切片、TTC(红四氮唑)染色 见图1～图2。

图1 大鼠MCAO模型

图2 大鼠MCAO模型

3.3 脑梗死体积的比较 3组均有梗死灶形成，但TK组梗死灶体积(30.54% ±3.47%)较NS组、空白对照组(38.43% ±5.73%，39.67%±4.98%)明显减轻(P＜0.05)。

3.4 缺血区NGF免疫组化结果 大脑中动脉闭塞后脑缺血区NGF增多，而注射TK后，NGF细胞明显增多，TK组与其他2组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2及图3～图4。

表2 各组脑组织切片中NGF灰度值比较()

表2 各组脑组织切片中NGF灰度值比较()

注:*与TK组比较，P＜0.05，#与NS组比较，P＞0.05

1d 3d 7d空白对照组 172.04±0.13*# 166.95±0.57 170.54±1.03*#组别NS组 173.10±0.24* 166.56±0.63*170.94±0.76*TK组166.32±0.37 154.64±0.51 160.86±0.38

图3 NS组3d NGF的表达(400×)

图4 TK组3d NGF的表达(400×)

4 讨论

有学者提出，脑组织缺血性损伤早期，如果KKS受到激活而参与一系列的生理生化反应，可以加重脑组织损伤，原因为KKS增加通透性和脑水肿［6］。Zausinger等［7］研究显示，在局灶性脑缺血前30 min给予激肽B2受体拮抗剂(LF16-0687MS)，可加快缺血性脑组织的功能恢复。另外，Xia等［8］提出，在脑组织缺血后 8 h，给予不同的治疗，结果不同:注射人TK基因可使大鼠缺血性脑梗死的体积缩小;而LF16-0687MS能加重缺血性脑梗死的再灌注损伤。得出不同的结论与TK治疗的时间有关:TK在早期可使脑水肿加重，但后期却能通过抑制细胞凋亡而起到神经保护作用。倪耀辉等［9］研究显示，在大鼠脑缺血再灌注后8 h给予TK，对脑缺血有明显的治疗作用，可减轻炎性反应，同时还能降低梗死灶内的细胞凋亡;明显增加缺血区神经细胞、神经胶质细胞和血管上皮细胞的增生。因此，推断TK是通过促进血管、神经组织再生以及抑制局灶缺血区的细胞凋亡、炎性反应而发挥治疗作用［10-11］。

本研究显示，在大鼠大脑中动脉闭塞再灌注后8 h注射TK，可改善大鼠的神经功能缺损，并减少大鼠脑梗死体积，使脑缺血区NGF表达增多。结果表明，在脑缺血较晚期，TK有明显的治疗效果。另外，应用TK治疗能明显增加缺血区的NGF表达，表明脑梗死时，TK有促进神经细胞再生的作用。NGF能加速神经元生长、分化及维持其功能，在脑内能保护神经元抵御很多类型的损伤。因此，得出结论，通过保护神经元、促进轴突再生而减轻中枢神经系统损伤。这为临床应用TK治疗缺血性脑梗死提供了重要的理论依据。

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