张峻颖，付 瑛，黄罗生

贞芪扶正注射液是根据“扶正培本、扶正驱邪”的祖国医学理论，以黄芪与女贞子等中药为原料制成的复方注射液，具有补气养阴、调节免疫功能的作用［1-2］。其中黄芪多糖是黄芪中含量最多、免疫活性最强的一类物质［3］。大量的研究表明，黄芪多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗辐射、降血脂、降血糖、保肝等多种功能［4-5］。女贞子多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖及岩藻糖4种糖组成，临床上常与其他中药配伍，用于治疗肿瘤及改善化疗后的白细胞减少等症状［6］。本实验采用4因素3水平正交试验L9(34)，选择多糖为综合考察指标，优化贞芪扶正注射液的提取纯化工艺，为其进一步开发、利用提供实验依据。

1 仪器与试药

GW751分光光度计，D-(+)-葡萄糖标准对照品(中国药品生物制品鉴定所);中空纤维超滤器(10 K，外流型)，北京市旭成超滤设备厂;BS-100A自动部分收集器，上海沪西分析仪器厂。

黄芪购自甘肃，经鉴定其原植物为蒙古黄芪，女贞子产地浙江，经鉴定为木犀科植物女贞的干燥成熟果实;甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计［7-8］按L9(34)表条件对女贞子与黄芪进行多糖的提取和测定，其收率与含量的加权平均值计入综合评判，并以其作为考察指标。为了提高统计分析的可靠性，每一个条件下都进行重复试验(n=2)，测定结果取其平均值供统计分析用。因素水平表见表1。

表1 因素水平表

2.2 多糖的提取与收率测定 取黄芪和女贞子药材，粉碎成粗粉，各称取100 g，按L9(34)组合试验条件进行提取，合并提取液，滤过;减压浓缩成每1 mL相当于1 g生药的药液，加乙醇至含醇量达90%，静置24 h，滤过;沉淀用95%的乙醇洗涤，挥尽乙醇，取沉淀加适量蒸馏水溶解，再加乙醇至含醇量达80%，静置24 h，离心滤过。沉淀用无水乙醇洗涤，减压过滤，低温干燥，即得多糖粗品，称重，与取药材量相比，即得收率。

2.3 5%苯酚溶液的配制 取苯酚100 g，加铝片0.1 g和碳酸氢钠0.05 g，蒸馏，收集182℃馏分，称取10 g置棕色瓶内，加水溶解并稀释至200 mL，摇匀，置冰箱中备用。对照品溶液的制备:精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品25 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。

2.4 标准曲线绘制［9］取经105℃干燥至恒重的葡萄糖25 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取储备液 0、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 共 7份，分别置25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。各精密量取2.0 mL，置具塞试管中，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL，摇匀，放置5 min，置水浴中加热15 min，取出，迅速冷却至室温。于490 nm波长处测定吸收值(A)，以A为纵坐标、葡萄糖对照品量为横坐标(C)，进行回归计算，得回归方程A=4.221C-0.022(r=0.999 1)。

2.5 样品含量测定 取“2.2”项下所得粗多糖约50 mg，105℃干燥至恒重，精密称定，置于50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2.0 mL，按“2.4”项下自“再加入5%苯酚溶液1.0 mL”起，依法测定吸收值。并依回归方程计算，得多糖的相对含量。为了与收率在综合分中占有相同重要地位，将其实际测得值缩小为原值的1/100供统计分析。

2.6 方差分析结果 见表2。

表2 方差分析表

将正交设计试验结果进行方差分析，结果表明，因素A(提取次数)差异有统计学意义(P＜0.05)，因素B(提取时间)及C(加水倍数)差异无统计学意义(P＞0.05)。因此，程度依次为A＞C＞B。各因素的最佳水平可确定为A3B1C1，即加8倍量水，煎煮3次，每次1.5 h。

2.7 验证实验 按照理论最佳工艺A3B1C1，进行验证实验，结果得率为2.0%，粗多糖含量为28.54%，得率及粗多糖含量较高，认为正交试验得出的结果可靠，且工艺稳定可行。

2.8 超滤法纯化贞芪总多糖 贞芪多糖中分子量在3 000～40 000的多糖是产生有效作用的物质［10］。贞芪多糖原液用装有能切割3 000～40 000分子量中空纤维超滤膜的超滤装置过滤，除去相对分子量＞4万的树胶等大分子物质。而影响超滤的主要因素有原液浓度(C)和压力(P)，采用正交试验设计［L4(22)］对其进行优化。据多糖自身特点，浓度选择0.25 mg/mL(C1)和0.50 mg/mL(C2)，压力选择0.15 MPa(P1)和0.20 MPa(P2)，流速为20 mL/min;将膜上液和膜下液分离，膜上液弃去不用，收集膜下液，为相对分子量3 000～40 000馏分，冷冻、干燥，得分离产物，得贞芪总多糖，将多糖的得率和多糖含量作为考察指标，考察超滤效果，结果见表3。

表3 超滤结果比较

由表1可见，超滤过程中，在原液浓度0.5 mg/mL、压力0.2 MPa下结果最好，其多糖的含量为59.4%。

2.9 贞芪扶正注射液的制备工艺 取上述步骤制备的贞芪总多糖，加适量注射用水使溶解，加等渗调节剂适量，用注射用水配成溶液，加入0.1%的针用活性炭，煮沸15～20 min，过滤，调节pH值至7.0～7.5，滤过;100℃流通蒸汽灭菌40 min，即得。

3 讨论

中药活性多糖作为生物免疫调节剂，通过提高机体的免疫功能，如增强细胞免疫和体液免疫作用达到抗肿瘤目的。

本研究采用传统的水提醇沉法制备贞芪多糖，并利用正交试验筛选最佳工艺条件，该方法简便易行，资源利用率高，生产成本低。

根据上述试验，贞芪多糖的提取纯化方案可确定为:药材加8倍量水，煎煮3次，每次1.5 h。合并提取液，滤过;减压浓缩成每1 mL相当于1 g生药的药液，加乙醇至含醇量达90%，静置24 h，滤过;沉淀用95%的乙醇洗涤，取沉淀加适量蒸馏水溶解，再加乙醇至含醇量达80%，静置24 h，离心滤过。沉淀用无水乙醇洗涤，减压过滤，低温干燥，得粗多糖。取0.5 mg/mL粗多糖原液可用装有能切割3 000～40 000分子量中空纤维超滤膜的超滤装置过滤，压力为 0.2 MPa，流速为20 mL/min，将膜上液和膜下液分离，收集膜上液，为相对分子量3 000～40 000馏分，冷冻、干燥，得贞芪总多糖。

为了除去杂质并最大限度保留有效成分，传统的提取纯化工艺经常采用在浓缩的水提液中，加入适量乙醇以除去其中的淀粉、小分子糖、单糖和蛋白质等杂质。

本研究采用膜分离技术代替了醇沉工艺，仅在膜分离之前采用醇沉作为前处理步骤。膜分离技术是一项新兴的高效分离技术，被公认为是20世纪末到21世纪中期最有发展前途的重大高新生产技术之一，目前已广泛应用于医药、食品、化工、环保等多个领域［11］。在中药制药企业中，主要用于去除药液中大量的鞣质、淀粉、蛋白质等非药用大分子物质，增加药品的澄明度和制剂质量。从本试验结果可以看出，使用超滤法分离多糖切实可行，且具有操作简单、节能、无污染、可在常温下连续操作等优点。但前提条件是，必须知道所要分离的多糖的相对分子量，这样才能有效地选取中空纤维超滤柱截留值，否则必须通过预选才能确定截留值。另外，超滤时压力不易过大，过大会影响膜的寿命。

［1］刘焕龙，陈雪彦，潘振华，等.注射用贞芪扶正对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用［J］.河北医药，2010，10(32):2660-2662.

［2］张红柏，耿慧，焦晓云，等.贞芪扶正颗粒防治阿霉素心脏毒性的临床研究［J］.山西医药杂志，2012，5(41):475-476.

［3］孔令梅.黄芪的免疫调节作用［J］.内蒙古医学杂志，2007，39(1):73-74.

［4］赵镕，高永翔.黄芪多糖的免疫调节作用研究进展［J］.中医临床研究，2012，4(5):4-6.

［5］蔡丽.黄芪多糖研究现状与进展［J］.中国肿瘤临床，2007，34(15):896-900.

［6］李璘，邱蓉丽，程革，等.女贞子多糖抗肿瘤作用研究［J］.中国药理学通报，2008，24(12):1619-1622.

［7］罗泳林，刘胜利，黄锁义.正交设计-超声提取重楼总皂苷［J］.实用药物与临床，2010，13(3):185-187.

［8］葛欣，盛杰，邱建国，等.正交实验法优化贞芪增免胶囊有效成分的提取工艺［J］.解放军药学学报，2009，25(1):17-20.

［9］周文兰，童列波.苯酚-硫酸法测定康克胶囊中多糖含量［J］.时珍国医国药，2001，12(7):505-506.

［10］杨金兰，武正簧.应用150CALC/GPC色谱仪测试黄芪多糖的分子量及其分布［J］.太原工业大学学报，1994，25(4):77-84.

［11］王文正，吕建国，何葆华.超滤在多糖中的应用研究［J］.化学与生物工程，2011，28(5):81-83.