单鸣秋，陈星，王侃，丁安伟

（南京中医药大学江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏 南京 210046）

炒炭前后茜草中1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌含量的UPLC测定△

单鸣秋*，陈星，王侃，丁安伟

（南京中医药大学江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏 南京 210046）

目的：建立茜草及茜草炭中1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌的UPLC测定方法。方法：采用Acquity BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm），流动相为甲醇-0.3%甲酸水，梯度洗脱，流速为0.2 mL·min-1，进样量为2μL，柱温30℃，检测波长276 nm。结果：1，3，6-三羟基2-甲基蒽醌在1.66～82.98μg·mL-1线性关系良好（r＝0.999 7），平均回收率为101.47%，RSD＝1.92%。结论：该方法简便、快速、准确，为优选茜草炭炮制工艺和建立茜草炭质量标准提供了科学依据。

茜草；炒炭；1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌；UPLC

茜草为茜草科植物茜草Rubia cordifoliaL.的干燥根和根茎［1］。茜草炭为茜草的炮制品，炒炭后寒性减弱，性变收涩，以止血为主。现代药理研究表明茜草炭止血作用增强，表现为复钙时间、凝血酶原时间及白陶土部分凝血酶时间缩短［2］。 《中国药典》2010版一部以大叶茜草素和羟基茜草素的含量来控制茜草药材和饮片的质量［1］，但对茜草炭没有作相应的规定。目前对茜草炭中的化学成分及其含量的研究较少。本实验利用UPLC法对茜草及茜草炭中1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌的含量进行了测定，比较和分析了炒炭前后含量变化的情况，为优选茜草炭炮制工艺和建立茜草炭质量标准提供了科学依据。

1 仪器与材料

Waters AcquityTM超高效液相色谱仪（包括：四元溶剂泵，自动进样器，光电二极管阵列检测器）；MASSLynxv 4.1数据工作站：超声机（昆山禾创超声仪器有限公司，KH-500B）；BP211D电子天平（d＝0.01 mg，Sartorius）。

1，3，6 -三羟基-2-甲基蒽醌对照品（自制，纯度97.4%）。甲醇和甲酸均为色谱纯，重蒸水自制。茜草购买于全国各地，经南京中医药大学吴启南教授鉴定均为茜草科植物茜草Rubia cordifoliaL.的干燥根和根茎。

2 方法与结果

2.1 茜草炭的制备

按照 《中国药典》2010版一部的有关规定，每批茜草取100 g，炒至表面焦黑色。

2.2 色谱条件

Acquity BEHC18色谱柱 （2.1 mm ×50 mm，1.7μm）；流动相为0.3%甲酸（A） -甲醇（B）；梯度洗脱如下：0～1 min，A为 90% ～90%；1～4 min，A为90% ～65%；4～9 min，A为65% ～40%；9～15 min，40% ～30%；15～20 min，30%～10%；20～22 min，10%～90%。流速：0.2 mL·min-1；柱温：30℃；进样量：2μL；DAD扫描：190～400 nm，经选择在276 nm下进行测定。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌对照品4.26 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得对照品溶液。UPLC图见图1。

2.4 供试品溶液的制备

取茜草及茜草炭粉末（过2号筛）约0.5 g，精密称定，置于50 m L具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，静置，上清液过0.22μm微孔滤膜，取滤液作为供试品溶液［3-5］。UPLC图见图2、3。

图1 1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌对照品UPLC图

图2 茜草UPLC图

图3 茜草炭UPLC图

2.5 线性关系考察

分别精密量取1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌对照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.5，5.0 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得系列对照品溶液，按上述色谱条件进样测定。以对照品溶液浓度X（μg·mL-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y＝77 881.38X-9 557.54（r＝0.999 7）。结果表明 1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌在1.66～82.98μg·mL-1与峰面积呈良好线性关系。

2.6 精密度试验

取茜草炭样品（产地：陕西，批号：101127）1份，照2.4项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次。结果1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌峰面积的RSD＝1.95%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取茜草炭样品（产地：陕西，批号：101127），按2.4项下方法制备供试品溶液6份，在上述色谱条件下进行测定。结果1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌的平均含量为0.794 mg·g-1，RSD＝2.21%，表明方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取2.6项下供试品溶液，室温下放置，在上述色谱条件下分别于0，1，2，4，6，8 h进行测定。结果 1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌色谱峰面积的RSD＝1.59%，表明供试品溶液在8 h内保持稳定。

2.9 回收率试验

取茜草炭样品（产地：陕西，批号：101127）6份，每份约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌对照品溶液1.2 mL，照2.4项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。

表1 茜草炭中1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌回收率试验

2.10 样品测定

取各批次茜草及茜草炭样品约0.5 g，精密称定，按2.4项下方法制备供试品溶液。按上述色谱条件测定，计算含量。结果见表2。

3 讨论

在本实验中，茜草和茜草炭供试品溶液均采用二极管阵列检测器在190～400 nm处进行全波长扫描。经过比较，在276 nm处，1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌具有较强吸收，色谱峰峰形较好且基线平稳，因此选择作为检测波长。

表2 样品中1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌的含量（n＝3）/mg·g-1

本实验结果表明，茜草炒炭后1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌含量显著升高。究其原因，可能是茜草中含有较多的以其为苷元的糖苷［6］，如1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌-3-O-（O-6-乙酰基）新橙皮苷、1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌-3-O-新橙皮苷、1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌-3-O-（O-6-乙酰基）-β-D-吡喃葡萄糖苷、1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌-3-O-β-D-吡喃木糖（1-2）-β-D（6-O-乙酰基）吡喃葡萄糖苷等，在炒炭过程中，上述糖苷的苷键断裂释放出苷元。

目前对茜草炭有关化学成分的研究较少，主要集中在大叶茜草素、羟基茜草素和1，3-二羟基蒽醌等3种成分［3-5］，但是炒炭后前者含量大幅降低，后两者绝对含量很低，均不适于作为指标性成分；而炒炭后1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌显著升高，在茜草炭中为主要成分，符合作为含量测定指标的要求。因此本实验以此为指标，建立了测定其含量的UPLC方法，并经过方法学验证，较HPLC法更加快速、准确，可以为茜草炭饮片质量标准的建立及茜草炭炮制工艺的优选提供科学依据。关于茜草炭止血作用的增强与1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌含量变化之间的具体关系还需进一步研究。

［1］国家药典委员会.中国药典［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：218-219.

［2］张卫华，张振凌，黄显峰，等.茜草炭饮片炒炭前后止血机制的比较［J］.中华中医药杂志，2006，21（3）：160-162.

［3］张振凌，周艳，张本山.茜草饮片炒炭前后大叶茜草素含量比较［J］.中国中药杂志，2005，30（5）：393-394.

［4］康辉，张振凌，周艳，等.HPLC测定茜草炭饮片中1，3-二羟基蒽醌含量［J］.中成药，2010，32（6）：980-982.

［5］杨宇婷，康文艺.HPLC法测定茜草及不同炮制品中大叶茜草素［J］.中成药，2011，33（12）：2125-2127.

［6］张琳，彭亮，胡本祥.茜草的化学成分研究进展［J］.现代中医药，2008，28（2）：52-54.

Determ ination of 1，3，6-trihydroxy-2-methylanthraquinone in Rubiae Radix et Rhizoma before and after Prepared by UPLC

SHAN Ming-qiu，CHEN Xing，WANG Kan，DING An-wei
（Nanjing University of ChineseMedicine，Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of TCM Formulae，Nanjing210046，China）

Objective：To establish an UPLC method for 1，3，6-trihydroxy-2-methylanthraquinone in Rubiae Radix et Rhizoma before and after prepared.Methods：An Acquity BEHC18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）column was used with methanol and 0.3%formic acid solution as themobile phase.The flow rate was0.2mL·min-1and volume of injection was 2μL.Column temperature was 30℃ and detective wavelength was 276 nm.Results：There was good liner relationshi Pbetween the peak area and concentration at ranges of 1.66～82.98μg·mL-1（r＝0.999 7）for1，3，6-trihydroxy-2-methylanthraquinone.The average recovery ratewas101.47%（RSD＝1.92%）.Conclusion：Themethod was rapid and simple with good accuracy and reproducibility for determination of 1，3，6-trihydroxy-2-methylanthraquinone in Rubiae Radix et Rhizoma before and after prepared.

Rubiae Radix et Rhizoma；Carbonizing；1，3，6-trihydroxy-2-methylanthraquinone；UPLC

2012-06-19）

中医药行业科研专项（20110700708）；《中国药典》2015年版课题——茜草炭的质量标准研究

*［通讯作者］单鸣秋，E-mail：shanmingqiu＠163.com