李保森 孙 颖 张连业 张 政 张 伟 赵 军 滕光菊 常彬霞 王福生 邹正升

人在幼年感染HBV后多数进展为慢性乙型肝炎[1]，而成人感染HBV后可表现为多种形式，如急性自限性肝炎、慢性乙型肝炎（CHB）或急性肝衰竭。CHB患者在一些诱因下可发生肝衰竭，被称为慢加急性肝衰竭（Acute-on-chronic liver failure，ACLF）[2]。ACLF患者病情重，治疗难度大，病死率高[3～5]。在中国，超过80%以上的肝衰竭患者为慢加急性乙型肝炎肝衰竭（Acute-on-chronichepatitisB liver failure，ACHBLF）。然而，目前对于导致ACLF的发病机制尚不清楚[6]。

树突状细胞（DCs）是体内最主要的抗原提呈细胞，其中 mDCs可表达 Toll样受体（TLRs）3、4、7 和8，主要产生IL-12，发挥抗原提呈功能；而浆性DC细胞（pDCs）则选择性表达TLR7和TLR9，是产生I型干扰素（IFNs)最主要的细胞[7]。最近有研究表明，肝组织内DC细胞在诱导和调节机体的局部免疫反应方面起着关键作用[8，9]。在正常生理条件下，肝内DCs主要产生IL-10，以维持肝脏的免疫耐受环境[10]。在肝炎病毒感染后，机体外周血淋巴细胞可以选择性地被募集到肝内，从而激发过量的免疫反应，导致肝损伤[11～13]。最近，研究发现丙型肝炎病人肝内DCs亚群处于功能紊乱状态[14]，但肝内DCs数量和功能特点尚不清楚。本研究分析了11例接受肝移植的ACHBLF患者肝组织DC亚群的数量及功能特点，以阐明其在ACHBLF发病中的作用。

资料与方法

一、资料来源 收集2007年以来在我院接受肝移植的ACHBLF患者11例，术前一天的临床资料见表1。另选慢性乙型肝炎患者10例和健康人（肝移植供体）5例。ACHBLF诊断标准参照文献[15]；慢性乙型肝炎诊断标准参照2010年发布的《慢性乙型肝炎防治指南》[16]。该研究获得我院伦理委员会的审核，患者签署知情同意书。

表1 11例ACHBLF患者肝移植前临床资料

二、外周血DC细胞表面标记及亚群的检测 采用美国BD公司生产的FACSCalibur流式细胞仪检测外周血及肝内DC亚群，即参照文献[17]分离外周血PBMC和肝脏内浸润的淋巴细胞（liver-infiltrating lymphocyte，LIL），将细胞悬浮到含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，调整细胞数为4×106/ml。取细胞悬液250μl，分别加人以下两组荧光抗体:①Linl-FICT（CD3/CD14/CD16/CD19/CD20/CD56-FITC）、CD123-PE、HLA-DR-PerCP（美国 BD 公司） 各 10μl；②Linl-FITC、CDllc-PE、HLA-DR-PerCP（美国BD公司）各10μl，室温避光孵育 20min，PBS洗涤细胞 2次，1500rpm离心5min，弃上清，1%多聚甲醛固定，24h内上流式细胞仪检测。Lin-1-HLA-DR+CD11c+细胞为 mDC，而Lin-1-HLA-DR+CD123c+细胞为pDC。检测结果采用FACSCalibur配置的CellQuest软件进行分析。

三、mDC和pDC功能检测 将分离的PBMCs或LILs细胞悬浮到含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，调整细胞数为4×106/ml。在24孔培养板中培养，加入PolyI:C（终浓度为26.5μg/ml）刺激mDC，加入CpG2216（终浓度为6μg/ml）和 IL-3（终浓度为 10ng/μl）刺激 pDC，同时设空白对照。37℃、5%CO2孵箱孵育24h，收集培养上清，置-80℃保存。采用ELISA法检测IFN-α、IL-12和IL-10水平。

四、肝内pDC和mDC鉴定 采用肝活检取得肝组织。采用免疫组化法，取新鲜肝组织，采用OCT包埋，置于-80℃冰箱保存。取OCD包埋的冻存肝组织，用冷冻切片机切片，厚5μm，室温放置30min，丙酮固定 10min，PBS洗涤3遍；以0.3%过氧化氢孵育10min，消除内源性过氧化物酶活性。然后，分别加入pDC特异性抗体BDCA-2（Clone AC144，Miltenyi公司）和mDC特异性抗体，即抗-CD11c（Clone B-ly6，BD Pharmingen 公司） 4℃孵育、过夜。取扁桃体作为阳性对照，同型抗体（鼠抗人IgG1）为阴性对照，加入二抗并显色，阳性细胞被染成红色。在400倍光镜下，随机挑选10个视野，对阳性细胞进行计数，计算平均数。

结果

一、ACLF患者外周血及肝内pDC和mDC分布情况 肝内pDCs百分比明显高于其外周血（图1A，P=0.039），差异具有统计学意义；但肝内mDCs的频率却与外周血类似（P=0.617），两者无统计学差异（图1B），提示ACLF患者pDCs可能已向肝内聚集。

二、PBMCs及LILs分泌细胞因子情况 我们以IFN-α分泌能力来判断pDC功能，以IL-12分泌能力判断mDC的功能。以PolyI:C刺激mDC，以CpG2216和IL-3刺激pDC培养后，上清液IFN-α和IL-12分泌增加，但LILs分泌细胞因子的能力较PBMCs明显降低，而分泌IL-10的能力却较PBMCs明显升高（图2）。

图2 ACLF患者LIL和PBMC分泌细胞因子能力比较

三、ACHBLF患者肝内DC亚群情况 ACLF患者肝内大量聚集BDCA-2阳性的pDCs和CD11c阳性的mDCs；CHB患者DC浸润较少，健康人肝细胞内几乎见不到DC聚集（图3）。细胞计数结果显示，三组之间肝内pDCs和mDCs之间的差异均有统计学意义（P值分别为P=0.003和P＜0.001）。

图1 ACLF患者外周血PBMCs及肝内LILs中DCs分布A：外周血PBMCs及肝内LILs中pDCs分布；B：外周血PBMCs及肝内LILs中mDCs分布

讨论

研究证实，免疫应答在机体免疫病理和病毒清除方面发挥着双重作用[18]，特别是肝内免疫反应强弱显著影响着HBV感染的疾病进展。根据表型和功能的不同，DC主要分为mDC和pDC两个主要亚群：前者主要分泌IL-12，介导T辅助细胞向TH1转化，而后者则专职产生IFN-α，可直接发挥抗病毒作用。肝衰竭患者肝内DC亚群的分布特点尚不清楚[8，9]。我们在11例接受肝移植的ACHBLF患者肝脏组织初步明确了pDCs和mDCs亚群的频率、分布和功能，从而为肝衰竭的发生机制研究提供了重要的依据。

Rastogi A等研究认为，肝组织学改变可以作为判断ACLF患者预后的预测因子[19]。我们发现ACLF患者肝内DC浸润数量明显高于慢性乙型肝炎及正常人，而肝内pDCs数量明显高于外周血，说明pDC有可能已向肝内聚集，而肝内mDCs数量与外周血相近[20]。

研究发现HBV转基因小鼠肝内激活的DC可产生IFN-α，从而发挥潜在的对抗HBV感染的免疫功能[21]。IFN-α也是主要的NK细胞激活因子。在CHB患者，激活的NK细胞可以诱导肿瘤坏死因子-相关的细胞凋亡-诱导配基（TRAIL）介导的肝细胞凋亡[22]。通过研究肝内pDC亚群的功能特点，我们发现，CpG2216可激活肝内pDC，使之产生IFN-α，而ACHBLF患者肝内pDC来源的IFN-α可能是触发肝内免疫反应的主要因子，因为体外研究发现CpG2216激活肝内的pDC产生IFN-α后可以促进LILs产生IL-12和IL-10。前者与乙型肝炎肝衰竭密切相关[23]，而后者是病毒感染后抑制免疫反应的主要因子。在肝衰竭及慢性乙型肝炎患者外周血IL-10水平明显升高[24]。我们用CpG2216刺激ACHBLF患者LILs，使其产生高水平的IL-10，可能能减轻ACHBLF患者的肝病症状。

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