桂华珍 阎秀英 肖 瑛 石明隽 郭 兵 张国忠*

（1 贵阳医学院机能学实验室，贵州 贵阳 550004；2 贵阳医学院病理生理学教研室，贵州 贵阳 550004）

近期的研究表明，肾小管上皮细胞凋亡在糖尿病肾病（DN）发病中起重要作用[1,2]，但糖尿病（DM）时肾小管细胞凋亡的发生机制仍有待进一步阐明。鉴于Bcl-2蛋白家族调节线粒体途径依赖的细胞凋亡，并且其他作者和我们既往研究表明，p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）介导了糖尿病肾小管损伤[3,4]，因此本研究旨在观察链尿佐菌素（STZ）诱导的大鼠DM发病过程中，肾小管Bcl-2、Bax和p38MAPK蛋白表达的动态变化，并探讨其相互关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体质量170～200g，购于上海西普尔-比凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2003-0002。大鼠适应性饲养一周，两次尿蛋白定性阴性并且空腹血糖在正常范围内者纳入实验。

1.2 试剂

链脲佐菌素（streptozotocin STZ，Sigma公司）；血糖检测试剂盒（四川迈克科技有限公司 ）；尿蛋白检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Bcl-2和Bax抗体、SABC即用型免疫组织化学试剂盒、DAB显色剂和ECL试剂（武汉博士德公司）；β-actin、p38MAPK和p-p38MAPK抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的IgG（Santa Cruz，USA）。

1.3 动物分组与模型制备

大鼠随机分为糖尿病组（DM）和正常对照组（N），每组30只，于实验2、4、8、16和24周处死。从尾静脉注射溶于pH4.5无菌柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液的STZ 55mg/kg复制大鼠模型，于注射后48h空腹血糖值≥16.7mmol/L 且尿糖阳性动物认为糖尿病模型成立。对照组大鼠尾静脉注射相应量的溶媒。

1.4 标本采集

动物处死前一天代谢笼收集24h尿液。处死前禁食6～8h，股动脉穿刺取血，分离血清。开腹取肾脏，一部分用4%多聚甲醛固定，另一部分－80℃保存。

1.5 生化指标检测

氧化酶法测血清葡萄糖；考马斯亮蓝法测尿蛋白浓度，其与24h尿量乘积为24h尿蛋白排泄量。

1.6 肾组织免疫组织化学检测

取多聚甲醛固定的肾脏制作石蜡切片，行免疫组织化学SABC法检测。Bcl-2和Bax一抗工作浓度均为1∶100。用PBS液代替一抗，作为阴性对照。DAB显色，苏木素复染。光镜观察细胞浆有棕黄色颗粒为阳性染色。在高倍镜下随机计数肾皮质10个不重复视野的免疫染色阳性肾小管数，取均值。

1.7 Western blot 检测

取-80℃保存的肾皮质加裂解液充分匀浆，离心取上清液上样，经SDS-PAGE垂直凝胶电泳后，电转移至PVDF膜。p38MAPK和p-p38MAPK一抗浓度为1∶200，β-actin一抗浓度为1∶300。ECL试剂曝光显影，凝胶成像系统进行图像分析（Bio-Rad），以靶蛋白/β-actin灰度比值表示靶蛋白的相对水平。

1.8 统计学方法

应用SPSS11.0统计软件进行数据处理。各组数据用均数±标准差（±s）表示，糖尿病组与对照组间资料比较采用t检验，糖尿病两组间资料比较采用单因素方差分析，用Pearson方法分析相关性，P＜0.05表示有显著性差异。

2 结 果

2.1 各组动物血糖和尿蛋白变化

与正常对照组比较，DM大鼠血糖明显升高，且在整个实验过程中一直维持于相对稳定的高水平（表1）。糖尿病2周24h 尿蛋白量明显高于对照组，且随着病程的进展呈进行性增多，见表1。

表1 大鼠血糖和24 h尿蛋白量变化 (±s，n=6)

表1 大鼠血糖和24 h尿蛋白量变化 (±s，n=6)

注：*正常组比较P＜0.01；▲与上一时点比较P＜0.05

DM N DM 2周 6.72±2.42 20.42±5.11* 2.01±1.21 23.36±8.91*4周 7.61±0.55 24.07±3.52* 5.28±2.31 32.30±8.35*▲8周 7.89±1.34 26.36±2.02* 7.73±1.22 27.26±8.51*16周 8.04±0.32 26.70±2.16* 7.65±1.24 49.38±10.86*▲24周 7.95±1.09 25.32±4.13* 8.76±1.19 55.37±3.22*▲组别 血糖值 (mmol/L) 24h尿蛋白(mg)N

2.2 Bax和Bcl-2蛋白在肾小管的表达

肾组织免疫组织化学结果显示，正常对照组肾小管上皮细胞Bax和Bcl-2蛋白有少量表达，糖尿病各组两者表达均显著增高。Bax蛋白随糖尿病进展而增多，糖尿病8、16和24周组Bax蛋白表达显著高于糖尿病2周组。糖尿病2和4周组Bcl-2表达相似，处于高水平，然而8周开始其表达减少，但24周仍然远高于对照组。Bax/Bcl-2比值随糖尿病病程进展而增高（表2和图1、2）。

表2 Bax和Bcl-2蛋白在肾小管的表达 (±s，n=6)

表2 Bax和Bcl-2蛋白在肾小管的表达 (±s，n=6)

注：*与正常组比较P＜0.01； ◆与糖尿病2周组比较P＜0.05； ▲与前一时点比较P＜0.05

Bcl-2 Bax/Bcl-2 N DM N DM DM 2周 0.05±0.08 6.83±1.25* 0.32±0.10 13.56±3.25* 0.47±0.14 4周 0.03±0.05 8.31±1.77* 0.14±0.05 13.68±2.51* 0.64±0.21 8周 0.08±0.10 9.45±2.01*◆ 0.21±0.10 10.25±2.20*◆ 1.02±0.25▲16周 0.08±0.13 11.92±3.33*◆ 0.33±0.34 8.90±2.61* ◆ 1.42±0.27▲24周 0.08±0.11 13.12±1.76*◆ 0.18±0.13 8.64±1.96*◆ 1.78±0.45▲组别 Bax

表3 大鼠肾皮质p38 MAPK and p-p38MAPK 蛋白相对水平 (±s，n=6)

表3 大鼠肾皮质p38 MAPK and p-p38MAPK 蛋白相对水平 (±s，n=6)

注：*与对照组比较 P＜0.01

对照 DM2周 DM4周 DM8周 DM16周 DM24周p38MAPK 0.16±0.02 0.23±0.06 0.88±0.14* 0.82±0.10* 0.87±0.08* 0.89±0.12*p-p38MAPK 0.00±0.00 0.08±0.02* 0.54±0.07* 0.75±0.12* 0.69±0.06* 0.66±0.09*

2.3 p38MAPK和p-p38MAPK表达

大鼠肾皮质Western blot结果表明，对照组可检测到少量p38MAPK蛋白，未检测到p-p38MAPK蛋白。DM2周 p38MAPK蛋白表达水平与对照组相似，但可检测到p-p38MAPK蛋白表达。DM4周时p38MAPK和p-p38MAPK蛋白均明显高于对照组和DM2周，并且在8、16和24周均维持于高水平（表3和图3）。相关性分析表明，p-p38MAPK蛋白与Bax/Bcl-2比值呈显著正相关（r=0.512，P＜0.05）。

3 讨 论

我们的实验结果显示，注射STZ后动物血糖明显升高，在整个实验过程中均维持在高水平，表明动物发生了糖尿病。同时，在DM2周出现蛋白尿，并且呈进行性增多，表明并发了糖尿病肾病或谓糖尿病肾疾病（DKD）。

DM2周肾小管Bax和Bcl-2蛋白表达显著高于对照组，并且Bax蛋白随DM病程进展呈进行性增多，而Bcl-2蛋白从DM8周开始减少。Bax/Bcl-2比值在DM2和4周＜1，8周接近1，16和24周则＞1。Bcl-2和Bax蛋白同属Bcl-2蛋白家族，但作用相反，前者使细胞存活而后者引起线粒体途径依赖的细胞凋亡。通常Bax与Bcl-2互为结合蛋白以相互拮抗的异二聚体形式存在于胞浆，两者比值决定着细胞命运，Bax/Bcl-2比值＞1时使细胞凋亡[5]。

p38MAPK为丝裂原活化蛋白激酶家族的重要成员，其活性形式即磷酸化形式p-p38MAPK介导多种生理和病理过程。有研究表明，p-p38MAPK使Bax蛋白激活并转移到线粒体外膜，使其通透性增高并释放细胞色素C和caspase-3而执行细胞凋亡[6]。Rane MJ等研究表明，大鼠糖尿病6个月时，p-p38MAPK表达增多致肾小管上皮细胞凋亡[7]。Khera 等的研究表明，高糖使Bax蛋白表达增多而Bcl-2蛋白表达减少，Bax/Bcl-2比值增高，从而使系膜细胞凋亡[8]。我们的结果显示，DM2周p38MAPK表达增多且检测到其活性形式p-p38MAPK，此后随病程进展p38MAPK表达和活化进一步增加，DM8周后维持在高水平，并且p-p38MAPK与Bax/Bcl-2比值呈正相关。鉴于我们过去的研究表明，在糖尿病大鼠肾皮质，p38MAPK主要表达于肾小管[4]，因此目前的研究提示了，糖尿病早期肾小管p38MAPK表达已增加及部分活化，并且在DM病程发展过程中持续高活性的p-p38MAPK可能介导了肾小管Bax蛋白表达增多和Bcl-2蛋白表达减少，使Bax/Bcl-2比值增高，从而参与糖尿病肾病的病理过程。

然而，我们的实验结果还表明，在DM2周时Bcl-2增高十分显著，即使此后随糖尿病病程进展而有所减少，但在DM24周依然显著高于对照组，提示在糖尿病发病过程中尚有其他机制在促进Bcl-2蛋白表达，有待进一步研究。

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[3]Lim AK,Nikolic-Paterson DJ,Ma FY,et al.Role of MKK3-p38MAPK signaling in the development of type Ⅱ diabetes and renal injury in obese db/db mice[J].Diabetologia,2009,52(2)：347-358.

[4]万昌武,肖瑛,石明隽,等.糖尿病大鼠肾小管P选择素和MCP-1的表达及调节机制探讨[J].军事医学科学院院刊,2007,31(5)：440-443.

[5]Toule RJ,Strasser A.The Bcl-2 protein family： opposing activities that mediate cell death[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2008,9(1)：47-59.

[6]Owens TW,Valentijn AJ,Upton JP,et al.Apoptosis commitment and activation of mitochondrial Bax during anoiks is regulated by p38MAPK[J].Cell Death Differ,2009,16(11)：1551-1562.

[7]Rane MJ,Song Y,Jin SY,et al.Interplay between Akt and p38MAPK pathways in the regulation of renal tubular cell apoptosis associated with diabetic nephropathy[J].Am J Physiol Renal Physiol,2010,298(1)：F49-F61.

[8]Khera T,Martin J,Riley S,et al.Glucose enhances mesangial cell apoptosis[J].Lab Invest,2006,86(5)： 566-577.