制备SD大鼠云南白药含药血清的实验条件筛选

2012-09-20李玛琳周轶平

中国医药指南 2012年3期

张莹李玛琳,2* 罗敏周轶平张昕

（1 昆明医学院药学院重点实验室，云南昆明 650500；2 云南中医学院，云南昆明 650500）

在众多具有治疗跌打损伤、强筋健骨的中药中，云南白药被誉为“中华瑰宝，伤科圣药”，自发明至今一百多年来，其独特的疗效名扬海内外。1984年日本学者田代真一提出含药血清实验方法，“含药血清”即给动物或人服用一定量的药物后，经过一定的时间采血所获得的血清。使用云南白药含药血清来进行科研实验不仅有助于骨修复的研究更是对中药作用的作用机制进行了更深的探讨。大鼠腹主动脉取血[1]是常用的制备血清的方法，其中很多条件都直接影响血清的制备是否成功，作者经过查阅文献和本实验室长期大量实验得到最佳的制备含药血清的实验条件，现从水浴时间、离心转速、离心时间和离心温度方面进行筛选加以证明，以供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

成年SD大鼠200只；云南白药粉剂；生理盐水；负压采血管；水浴锅；常温离心机；低温离心机。

1.2 实验方法

选择健康SD大鼠200只，体质量（200±20）g，雌性，常温饲养，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”[2]配置云南白药溶液，连续4d给药，给大鼠灌胃的云南白药剂量相当于临床成人等效剂量（36mg/d），前3 d每日剂量分2次灌胃，第4天禁食12h后一次性灌服全天剂量[3]，1h后用质量浓度2%，即0.2mL/100g体质量的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，参照车兆义[4]等报道的方法腹主动脉取血与负压采血管中，每只大鼠取2管血每管约4mL，每种条件做筛选时其他条件保持不变，拟设37℃水浴15min后常温下3000r/min离心15min为参考条件后进行实验。

2 实验条件的筛选

2.1 水浴时间

取100管成功采得血样，随机分为4组每组25管，进行：静置5min；37℃水浴5min；37℃水浴15min；37℃水浴30min，4种处理。后常温下3000r/min离心15min，结果：静置组12管分离成功，13管出现溶血（图1）或分离不彻底现象（图2）；5 min组全部出现溶血或分离不彻底现象；15min组全部成功分离（图3）；30 min组4组成功，21管出现溶血或分离不彻底现象。

2.2 离心转速

取120管成功采得血样，随机分为3组每组40管，37℃水浴15min，后进行1000 r/min；3000 r/min；5000r/min，3种处理。常温下离心15min，结果：1000r组15min后，全部分离不彻底，又继续进行15min离心，其中28管分离出少量血清，12管溶血或仍分离不彻底；3000 r组39管分离成功，1管分离不彻底；5000 r组15min后全部溶血。

2.3 离心时间

取90管成功采得血样，随机分为3组每组30管，37℃水浴15min，3000r/min常温下离心，分别设置5min；15min；30min，3种处理。结果：5min组全部分离不彻底或分离不开；15min组全部成功分离；30min组11管成功分离，19管出现溶血。

2.4 离心温度

取90管成功采得血样，随机分为2组每组45管，37℃水浴15min，分别进行3000r/min常温离心15min和3000r/min低温（4℃）离心15min两种处理。结果：低温组全部成功分离；常温组1管出现分离不彻底，其余成功分离。

3 结果与讨论

含药血清相较中药粗制剂体外实验方法优势体现在复方药物的体内生物转化效应和克服了药物本身理化性质（如杂质、酸碱度、渗透压、pH值等）对实验的干扰[5]，实验动物采血制备含药血清过程中，实验条件的选择是不容忽视的方面，不恰当的条件直接影响到血清制备的成败和量的多少，而失败的实验不仅会影响实验进度也会造成不必要的资源浪费，本实验经对分离血清时的各种条件筛选后得出：采得血样后进行水浴有助于血清的分离成功，且水浴的时间在15～20min最为合适，时间过短起不到凝结沉淀血细胞的效果，而时间过长[6]容易导致溶血。离心转速在3000r/min为宜，太慢会导致分离不彻底且时间太久容易出现溶血，太快易导致血细胞破碎而出现溶血。离心时间15min最为合适，太长和太短都不利于血清的分离。另外发现温度对血清的分离可能没有直接的影响，实验表明常温和低温下离心都可以成功分离血清。作者认为在符合自己实验设计要求的基础上应尽可能减少大鼠使用量和提高血液的利用率，选择正确的实验条件能有效地提高实验效率和降低试验成本，以保证实验的顺利进行。