崔平平，张明珠，税艳青，徐 杰，赵瑜敏，雷雅燕

(昆明医科大学附属口腔医院口腔内科，云南昆明650031)

流行病学研究发现牙周病与全身性疾病有关［1］，牙周病可能是冠心病的一个重要的危险因素。动脉粥样硬化(AS)是严重威胁人类健康的疾病，其斑块的破裂可触发急性冠脉综合症(ACS)的发生，表现为不稳定心绞痛、急性心肌梗塞和猝死。在促进AS和RS发生、发展的众多因素中，越来越多的实验证实炎症和细胞因子是主要的危险因素，其中TNFα、IL－1与AS的关系较为密切。血液炎性细胞及血管内皮细胞和 VSMCs均能分泌TNF－α、IL－6、IL－8 及血小板活化因子(PAF)，且这些因子之间具有复杂的交互作用［2］。

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)是牙周病的主要可疑致病菌，研究发现在动脉粥样斑块中存在 Pg 的 DNA［3－4］，但其在 AS 发生及发展中的作用机制目前尚不清楚，本研究试图通过观察Pg上清液对体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)合成分泌细胞因子的变化，探讨Pg对AS可能的影响，为研究牙周炎与动脉粥样硬化的关系提供实验室依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料和试剂

牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277株(四川大学华西口腔医院国家重点实验室);抗人第Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体(福建迈新);噻唑蓝(MTT sigma公司，美国 );Rabbit IL－1β ELISA KIT、Rabbit IL－6 ELISA KIT(R＆D公司，美国);高纯总 RNA快速提取试剂盒(离心柱型，北京远泰生物技术有限公司);TaKaRa PrimeScript One Step RT－PCR Kit Ver.2(TaKaRa 公司);兔 β－actin、IL－1β、IL－6 引物(大连宝生物公司)。

1.2 Pg的培养及上清的提取

取Pg标准菌株常规复苏后接种于加有羊血及VitK1的CDC培养板上，37℃厌氧(800 mL/L N2、100 mL/L H2、100 mL/L CO2)培养72 h，形态学检查后，挑取菌落转种于BHI液体培养基中增菌24 h。然后取100 μL增菌菌液在硫乙醇酸盐中以1/10的比例倍比稀释至原始浓度的10－7，分别取10－5、10－6、10－7三个浓度的稀释液各 100 μL 分别在CDC培养板上涂板，继续培养48 h后计菌落数，推算出原始菌液的浓度。其余增菌菌液8 000 r/min，4℃离心15 min，取Pg上清过滤后分装入1.5 mL EP管，－80℃保存备用。

1.3 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的培养及鉴定

人脐静脉均来自昆明医科大学第一附属医院产科，经产妇知情同意后，剪取脐带15～20 cm，PBS冲洗，用1g/L I型胶原酶37℃消化15 min，1 000 r/min离心10 min;加入培养液5 mL吹打成细胞悬液，以5×107/L～1×108/L的细胞密度转移至25 cm2的培养瓶中，37℃、50 mL/L CO2条件下培养并传代，12 h换液1次。取第3代细胞进行人第Ⅷ因子相关抗原免疫组化及透射电镜观察进行细胞来源鉴定。

1.4 RT－PCR 法检测 IL－1β 和 IL－6 mRNA 的表达水平

取第5代HUVECs以2.5×105/mL的密度接种于25 mL培养瓶并随机分为两组，实验组加入ECM稀释的5×106CFU/mL的Pg上清液5 mL;对照组加入等量ECM培养液37℃，50 mL/L CO2条件下进行培养。分别于培养6、12、18、24 h提取各组细胞总 RNA，用下列引物(表1)进行一步法RT－PCR反应:反应体系按照94℃预变性3 min，94℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，共 35 个循环，72℃ 10 min延伸终止反应。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外仪下观察，并使用计算机图像采集系统拍照，分析凝胶目的条带灰度值。以目的基因条带的灰度值与内参β－actin条带的灰度值的比值作为目的基因表达强弱的指标。

表1 引物序列

1.5 ELISA法检测 Pg上清对 HUVECs生成IL－1β和 IL－6 蛋白水平的影响

取第5代HUVECs以5×104/mL的密度接种于96孔培养板，上述条件培养至细胞贴壁后随机分为实验组和对照组，实验组加入用ECM稀释的5×106CFU/mL的Pg上清液200 μL;对照组加入等量ECM培养液继续培养。分别于培养6、12、18、24 h取各组细胞，每组复6孔，ELISA法检测HUVECs生成IL－1β和IL－6蛋白的水平。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 HUVECs的形态学观察及细胞鉴定

倒置显微镜下观察内皮细胞原代培养3 d后完全融合形成“铺路石”样的单层细胞。细胞呈多角形或椭圆形，边界清楚，胞浆丰富，细胞核较大，有1～3个核仁(图1)。免疫组化检测抗人第Ⅷ因子相关抗原阳性(图2黑色箭头示)。透射电镜观察，HUVECs核膜清晰，胞浆内富含微管、线粒体、内质网结构。且可见HUVECs特征性标志的Weibel－Palade(W－P)小体，其横切面呈圆形，周围有膜包绕;纵切面呈杆状，其中可见小管状结构(图3～4，黑色箭头示W－P小体)。

图1 原代培养第3天的HUVECs形态 (×10)

图2 UVECs免疫组化鉴定(×40)

图3 HUVECs的超微结构(W－P小体横切面)

图4 HUVECs的超微结构(W－P小体纵切面)

2.2 Pg上清液对 HUVECs IL－1β 和 IL－6 mRNA表达的影响

RT－PCR反应产物凝胶电泳结果见图5。以目的基因条带灰度值与内参β－actin条带灰度值的比值作为目的基因表达强弱的指标，对不同时间点进行比较发现，IL－1β mRNA水平在Pg上清液刺激12、18 h时的表达高于对照组，差异有统计学意义(P ＜0.05)，刺激 6、24 h 时两组无统计学差异(P＞0.05)(图6);IL－6 mRNA水平在Pg上清液刺激12 h的表达明显高于对照组(P＜0.05)，而其他各时间点两组均无统计学差异(P＞0.05)(图7)。

2.3 Pg上清液对 HUVECs生成 IL－1β 和 IL－6蛋白水平的影响

IL－1β蛋白在Pg上清液刺激18、24 h的表达量明显高于对照组(P＜0.05);而6、12 h两组无统计学差异(P＞0.05)(图8)。IL－6蛋白在Pg上清液刺激12、18、24 h三个时点均明显高于对照组(P ＜0.05)(图9)。

图5 RT－PCR反应产物凝胶电泳图(Treat为实验组，Control为对照组)

3 讨论

牙周炎是由牙周致病菌导致的一种炎症性疾病，牙龈卟啉单胞菌是目前公认的引起牙周炎的常见致病菌，能表达多种潜在的毒力因子。鲁维希等［5］将 Pg等牙周致病菌的 BHI增菌液进行15 000 r/min离心10 min后取其上清液用核磁共振代谢图谱法进行研究发现，Pg菌液经高速离心后的上清液内保留了Pg的主要致病成分，可代表Pg的毒性成分，所以本实验选择 Pg上清液与HUVECs共同培养，观察其对 HUVECs合成、分泌IL－6和 IL－1β 的影响。

另外，我们前期的实验结果发现，Pg上清液在高浓度(＞5×106CFU/mL)时，对 HUVECs的增殖有明显的抑制作用，在相对低浓度(≤5×106CFU/mL)时对 HUVECs的增殖则无明显影响。故选择对细胞增殖无明显抑制作用浓度组中的最高细菌浓度作为本实验的细胞刺激浓度。

血管内皮细胞在Pg的直接和间接作用下，可通过分泌大量的粘附分子或炎性介质促进单核巨噬细胞的聚集与粘附，促进平滑肌细胞的增殖与迁移，在血管内膜下吞噬氧化的脂质而形成大量的泡沫细胞;同时，由于内皮功能受损，内膜下的胶原暴露，组织因子大量释放，引起血小板的活化和血栓形成，共同导致AS的发生［6］。有研究显示，Pg纤毛、内毒素、细菌外膜蛋白和热休克蛋白可刺激人内皮细胞表达血管间细胞粘附分子(VCAM－1)、细胞间粘附分子(ICAM－1)、E－选择素和P－选择素等，并观察到其炎症基因表达上调［7－8］。

白细胞介素 －1(interieukin－1，IL－l)是一种强效的炎症反应调节因子，主要由单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞等产生，具有调节免疫反应和介导炎症反应发生的双重作用。Bhaskar等［9］研究发现，体内运用抗IL－lβ抗体可抑制载脂蛋白缺陷鼠动脉斑块的形成。Wang等［10］认为，IL－lβ 浓度可作为诊断急性冠脉综合征的炎症指标。

IL－6是一种多功能细胞因子，可由成纤维细胞、上皮细胞、单核巨噬细胞、成骨细胞、血管内皮细胞等多种细胞合成分泌。近年的流行病学研究和临床研究提示:IL－6是心血管疾病有力的独立预示因子之一。Lai等［11］认为，IL－6可能是判断心血管疾病严重程度的重要指标，与动脉硬化斑块的活动性密切相关。McDermott等［12］认为，持续的高IL－6水平与外周动脉疾病快速功能下降有关。以上研究表明，IL－6是反映动脉粥样硬化演进的重要标志物，且对远期心血管事件具有预测价值。

本结果显示，以5×106CFU/mL浓度的Pg上清液刺激HUVECs后，细胞上清中的IL－1β和IL－6的基因表达增强，蛋白表达水平均增高，而且其基因的高表达早于相应蛋白的表达。提示，Pg可通过促进 HUVECs的 IL－1β、IL－6的表达，从而在AS的发生发展中起到促进推动作用。但是，牙周炎对AS的影响究竟是通过致病菌毒力因子直接刺激内皮细胞而导致的炎症因子水平升高，还是通过局部组织炎症因子的释放使得外周血液中IL－1β和IL－6水平升高从而对内皮细胞发挥间接的损伤作用，还有待进一步的探索。

［1］Meurman JH，Sanz M，Janket SJ.Oral health，atherosclerosis，and cardiovascular disease［J］.Crit Rev Oral Biol Med，2004，15:403－413.

［2］吴兴利，王士雯，徐雅琴，等.银杏叶提取物对兔血管平滑肌细胞分泌细胞因子的影响［J］.中国新药与临床杂志，2003，22(5):292－295.

［3］Kozarov E，Sweier D，Shelburne C，et al.Detection of bacterial DNA in atheromatous plaques by quantitative PCR［J］.Microbes Infect，2006，8(3):687 －693.

［4］Fiehn NE，Larsen T，Christiansen N，et al.Identification of periodontal pathogens in atherosclerotic vessels［J］.J Periodontol，2005，76:731 －736.

［5］鲁维希，吴亚菲，肖丽英，等.牙周可疑致病菌代谢组学鉴定的初步研究［J］.华西口腔医学杂志，2009，27(3):310－312，316.

［6］周小波，吴慧琴，张雪梅，等.血管内皮炎症与动脉粥样硬化［J］.中国心血管病研究，2008，6(4):308 －309.

［7］Kocgozlu L，Elkaim R，Tenenbaum H，et al.Variable cell responses to P.gingivalis lipopolysaccharide［J］.J Dent Res，2009，88(8):741 －745.

［8］Hashizume T，Kurita－Ochiai T，Yamamoto M.Porphyromonas gingivalis stimulates monocyte adhesion to human umbilical vein endothelial cells［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2011，62(1):57－65.

［9］Bhaskar V，Yin J，Mirza AM，et al.Monoclonal antibodies targeting IL－1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E－deficient mice［J］.Atherosclerosis，2011，216(2):313 －320.

［10］Wang YN，Che SM，Ma AQ.Clinical significance of serum cytokines IL－l beta，sIL－2R，IL－6，TNF－alpha，and INF－v in acute coronary syndrome［J］.Chin Med Sci J，2004，19(2):120 －124.

［11］Xing JP，Zhao JO.Relationship between coronary atherosclerosis plaque characteristics and high sensitivity C－reactive proteins，interleukin－6［J］.Chin Med J(Engl)，2011，124(16):2452－2456.

［12］McDermott MM，Liu K，Ferrucci L，et al.Relation of interleukin－6 and vascular cellular adhesion molecule－1 levels to functional decline in patients with lower extremity peripheral arterial disease［J］.Am J Cardiol，2011，107(9):1392 － 1398.