李博，蔡恒江、2，刘长发、2

(1.大连海洋大学海洋科技与环境学院，辽宁大连116023;2.辽宁省高校近岸海洋环境科学与技术重点实验室，辽宁大连116023)

赤潮是全球性的海洋生态灾害。20世纪以来，随着海洋污染和富营养化的日趋加重，世界各地沿海赤潮频繁爆发，且引发赤潮的微藻种类越来越多，赤潮影响的区域面积也越来越大，尤其在亚洲赤潮频发现象更为严重［1］。由于赤潮生消过程及其物理、化学和生态学过程相互作用的复杂性，目前还没有非常理想的治理方法。利用海洋环境中的生物因子进行赤潮的防控已引起人们的重视［2-3］，其中利用大型海藻与微藻间的相互作用来预防或控制赤潮是一个新的研究方向［4］。

在水域生态系统中，大型海藻和微藻之间存在着“拮抗”关系［5-7］。大型海藻与海洋微藻同处于海洋生态系统初级生产者的地位，生态位高度重叠，与微藻竞争营养、光照和生长空间等。大型海藻不仅能够净化水质，还能与赤潮微藻进行营养竞争，防止赤潮微藻的爆发性繁殖与增长［8］。当光照和营养盐充足时，大型海藻对浮游藻类有明显的生化抑制效应，大型海藻能够向环境中释放相生相克类化合物，抑制赤潮微藻的生长［9-10］。

本研究中，作者采用室内模拟试验方法，研究了角叉菜对两种赤潮微藻的克生作用，以期为赤潮防控提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

米氏凯伦藻Karenia mikimotoi和微小原甲藻Prorocentrum minimum由中国海洋大学微藻培养中心提供，两种藻均属赤潮藻种。

大型海藻角叉菜Chondrus ocellatus采集于大连市黑石礁海域，将角叉菜表面的杂藻去除，用蒸馏水洗去泥沙及其它附着物，再用灭菌海水漂洗3～4次，预培养于f/2培养液中［11］。

1.2 方法

1.2.1 培养方法和条件 天然海水采自大连市黑石礁海域，经过脱脂棉过滤、灭菌，冷却至室温，用玻璃纤维素膜 (0.45 μm孔径)过滤除去颗粒物质，将pH和盐度分别调至8.5和30。培养液采用f/2营养盐配方，培养温度为 (20±1)℃，光照强度为3 000 lx，光暗周期为12 h∶12 h。用于微藻培养的300 mL三角瓶预先用1 mol/L的盐酸浸泡24 h，用灭菌海水冲洗干净后待用。

以下所有试验中，每个三角瓶中均加入150 mL f/2培养液，每个试验设3个平行组。试验共进行12 d，每天从培养瓶中定时采样1 mL，观察微藻细胞密度的变化。取样后每个培养瓶中再加入f/2营养盐，以弥补营养盐的不足［12］。

1.2.2 新鲜角叉菜对两种有害赤潮微藻的作用试验 将处于指数生长期的米氏凯伦藻和微小原甲藻分别与不同含量的新鲜角叉菜共同培养于300 mL三角烧瓶中，两种微藻的起始密度均为1×104个/mL，每个瓶中新鲜角叉菜的含量分别设置为0(对照)、0.333、0.667、1.333、2.667 g/L。

1.2.3 角叉菜干粉末对两种有害赤潮微藻的作用试验 将新鲜的角叉菜在室温下完全干燥7 d，然后用研钵研磨成粉末。将处于指数生长期的米氏凯伦藻和微小原甲藻分别与不同含量的角叉菜干粉末共同培养于300 mL三角烧瓶中，两种微藻的起始密度均为1×104个/mL，每个瓶中角叉菜干粉末的初始含量分别设置为0(对照)、0.167、0.333、0.667、1.333 g/L。

1.2.4 不同浓度的角叉菜水溶性抽提液对两种有害赤潮微藻的作用试验 取新鲜角叉菜10 g，加入少许蒸馏水研磨成浆，以3 000 r/min离心15 min。取上清液，用海水定容至50 mL，以此液为母液，用海水将其分别稀释为系列梯度浓度:0(对照)、0.667、1.333、2.667、5.333 g/L，将两种有害赤潮微藻立即分别接种于不同浓度梯度的水溶性抽提液中。

1.2.5 角叉菜培养水过滤液对两种有害赤潮微藻的作用试验

1)一次性培养 在每升f/2培养液中加入80 g/L的新鲜角叉菜，培养7 d后，移去新鲜角叉菜，将培养液经玻璃纤维素滤膜 (0.22 μm)过滤，以消除滤液中的细菌。将两种有害赤潮微藻立即分别接种于上述培养角叉菜的过滤液中，并适量添加f/2培养液。以在过滤的f/2培养液中培养两种有害赤潮微藻作为对照。

2)半连续培养 按照上述方法将两种有害赤潮微藻分别接种于角叉菜培养液的过滤液中，每天将每个培养瓶中的150 mL培养液移出30 mL，再重新加入30 mL角叉菜培养液的过滤液，对照组每天续加30 mL f/2培养液。

1.2.6 微藻细胞密度的测定 微藻用Lugol碘液固定，采用平板计数法，在Olympus双筒显微镜下进行细胞计数。

1.3 数据处理

试验数据均采用SPSS 11.0进行统计分析。

2 结果

2.1 新鲜角叉菜对两种有害赤潮微藻的作用

从图1可见，新鲜角叉菜对米氏凯伦藻和微小原甲藻的生长有明显的抑制作用，且随着新鲜角叉菜含量的增加，抑制作用愈加明显。当新鲜角叉菜含量为2.667 g/L时，微小原甲藻细胞在第8天被完全杀灭;而米氏凯伦藻在试验过程中并未完全被杀灭。

图1 与新鲜角叉菜共培养时米氏凯伦藻、微小原甲藻的生长曲线Fig.1 Growth curves of K.mikimotoi，and P.minimum coexistence with fresh tissues of C.ocellatus

2.2 角叉菜干粉末对两种有害赤潮微藻的作用

从图2可见，角叉菜干粉末对米氏凯伦藻和微小原甲藻的生长也有明显的抑制作用。当角叉菜干粉末浓度为0.667、1.333 g/L时，米氏凯伦藻第4天全部死亡;当角叉菜干粉末浓度为1.333 g/L时，微小原甲藻细胞第2天就全部死亡，角叉菜干粉末浓度为0.333、0.667 g/L时，微小原甲藻细胞在第4天全部死亡。

图2 与角叉菜干粉末共培养时米氏凯伦藻、微小原甲藻的生长曲线Fig.2 Growth curves of K.mikimotoi，and P.minimum coexistence with dry powder of C.ocellatus

2.3 角叉菜水溶性抽提液对两种有害赤潮微藻的作用

从图3可见:较高浓度的角叉菜水溶性抽提液对米氏凯伦藻和微小原甲藻的生长有明显的抑制作用，其中米氏凯伦藻的生长受到了明显的影响，且抑制作用随角叉菜水溶性抽提液浓度的升高而加强;较低浓度的角叉菜水溶性抽提液 (0.667、1.333 g/L)对微小原甲藻的生长有明显的促进作用，较高浓度的角叉菜水溶性抽提液 (2.667、5.333 g/L)则能明显地抑制该藻的生长。

图3 与角叉菜水溶性抽提液共培养时米氏凯伦藻、微小原甲藻的生长曲线Fig.3 Growth curves of K.mikimotoi，and P.minimum coexistence with aqueous extracts of C.ocellatus

2.4 一次性和半连续添加角叉菜培养水过滤液对两种赤潮微藻的作用

图4为角叉菜培养水过滤液在一次性和半连续添加方式下对米氏凯伦藻和微小原甲藻的作用结果。从图4可见:在一次性添加方式下，角叉菜的培养水过滤液对米氏凯伦藻的生长没有显著的抑制作用 (P＞0.05)，但在半连续添加方式下，米氏凯伦藻的生长受到了显著抑制 (P＜0.05);而对于微小原甲藻，无论在一次性还是在半连续添加方式下，角叉菜培养水过滤液对该藻的生长都有显著的抑制作用 (P＜0.05)。

3 讨论

3.1 角叉菜克生赤潮微藻生长的可能机制

植物间的相生相克作用是指一种植物通过向环境中分泌化合物而影响其它生物生长的现象［13］。Hogetsu等［14］的研究发现，大型海藻分泌的相生相克类化合物能够抑制其它藻类的生长，并首次提出利用大型海藻的克生作用来控制微藻生长的观点;Keating［15］的研究证明，相生相克类化合物能够明显抑制浮游植物的演替;Jin等［10］的研究认为，石莼分泌的一些相生相克类化合物能抑制共培养体系中赤潮异弯藻和塔玛亚历山大藻的生长。另一方面，大型海藻能够通过对周围环境中营养物质的竞争性吸收来抑制其它藻类的生长［8］。本试验中每天都补充营养盐，以弥补营养盐不足带来的影响。

图4 在一次性和半连续角叉菜培养水过滤液添加方式下米氏凯伦藻、微小原甲藻的生长曲线Fig.4 Growth curves of K.mikimotoi，and P.minimum under initial or semi-continuous culture medifiltrate supplemented with C.ocellatus

角叉菜的新鲜组织和干粉末对米氏凯伦藻和微小原甲藻的生长均有明显的抑制作用，在较高的浓度下还能完全杀死藻细胞。Nakai等［2］的研究发现，大型海藻Myriophyllum spicatum能够持续向环境中分泌一种不稳定的、对蓝藻生长具有抑制作用的相生相克类化合物。本试验结果表明，角叉菜水溶性抽提液对两种赤潮微藻的生长皆有抑制作用，且抑制作用随角叉菜浓度的升高而加强。这表明角叉菜组织中具有抑制赤潮微藻生长的克生物质，进一步证明克生物质的存在是角叉菜对赤潮微藻产生克生效应的主要方式之一。角叉菜培养水过滤液在一次性培养方式下对米氏凯伦藻的生长没有显著影响，而在半连续培养方式下有显著的影响，可以推断角叉菜分泌了非常容易降解的克生物质，并且大型海藻活体组织里克生物质的连续分泌是有效抑制赤潮微藻生长的关键。另外，Gross等［4］的研究认为，相生相克类化合物是通过细胞间的直接接触传递至目标生物的，而本试验结果与上述结果不同。因为角叉菜能够直接将相生相克类化合物分泌到周围环境中，因此，角叉菜对赤潮微藻产生的克生作用并不是通过细胞间的直接接触实现的。

3.2 角叉菜在赤潮防治中的作用

大型海藻能够产生或向周围环境中分泌化学物质，从而抑制环境中浮游生物的生长，它是海藻的一种有效的防御机制，能够确保其在与其它光合作用植物的竞争中保持优势。如Gross等［4］曾经报道，大型海藻能够向周围水体中分泌多酚类物质，这种物质能强烈抑制水体中蓝细菌的生长;Van等［16］的研究表明，Ceratophyllum demersum通过分泌相生相克类化合物来抑制水体中一些附生植物和浮游植物的生长;Jasser［17］研究发现，C.demersum能够分泌相对分子质量为3 000左右的化合物，这种化合物能够抑制水体中蓝细菌的生长，从而改变了水体中浮游植物的优势种群结构;Jeong等［9］的研究结果也表明，海藻Corallina pilulifera可以通过分泌相生相克类化合物杀灭共培养体系中的赤潮微藻;孔石莼所分泌的相生相克类化合物同样能明显抑制与之共培养的8种微藻［18］。这些研究都表明，大型海藻可能是一种潜在的生物调控因子，它能在赤潮的防控中发挥重要作用。

角叉菜分泌或产生的相生相克类化合物能够影响或杀灭共培养体系中的赤潮微藻，这种特性使得其可能在赤潮的调控方面具有重要作用。但是，角叉菜是一种潮间带生物，而赤潮一般发生在远离海岸带的地方，因此角叉菜不能被直接引入到特定水域中进行赤潮的防控。本试验结果显示，角叉菜所分泌或产生的活性物质同样具有杀藻作用，因此，可以将提取、纯化后的活性物质用于杀灭赤潮微藻，但其用量或潜在的生态效应还有待进一步研究。

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