李颖，周一兵，万良，赵欢，杨大佐

(大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室，辽宁大连116023)

热休克蛋白70(Hsp70)由于其具有多方面的生物学功能成为被广泛研究的一组蛋白［1-2］。Hsp70作为蛋白成熟过程中的分子伴侣，能与变性蛋白质结合，修复错误折叠蛋白或加速其降解，参与应激条件下细胞必需蛋白质空间构象的维持，在对抗包括高温、低氧、缺血、紫外线、重金属离子、DNA损伤、环境毒物等环境胁迫引起的损伤中发挥重要作用［3-4］。同时，热休克蛋白还具有抗细胞凋亡、促进细胞增殖、抗氧化、使生物获得耐热性、稳定细胞膜结构、免疫等生物学作用。正常条件下机体Hsp70表达量较少，外界环境胁迫下机体Hsp70表达量会明显升高。鉴于Hsp70与环境胁迫引起的机体损伤之间的关系，Hsp70作为生物标记物用于环境监测受到广泛关注。沈骅等［5-7］探讨了鲫Carassius auratus肝脏组织Hsp70作为重金属污染条件下生物标记物的潜力。对Hsp70的初步研究结果显示，Hsp70作为生物标记物在水环境检测方面具有一定潜力。Radlowska等［8］研究表明，高浓度重金属污染可导致紫贻贝Mytilus edulis体内Hsp70表达水平升高，且其表达量在铜、镉联合作用下变化更加显著。另有研究表明，海胆、贝类和多种鱼类体内Hsp70表达量会随着温度变化发生显著变化［9-12］。目前，已对多种海洋生物Hsp70基因序列和蛋白功能进行了研究，然而对双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis Hsp70基因的研究迄今尚未见报道。

双齿围沙蚕是广泛分布于中国沿海潮间带及河口潮滩的优势底栖动物，隶属于环节动物门、多毛纲，是重要的经济多毛类。由于其底栖生活习性，双齿围沙蚕受环境污染物影响的可能性增大，其对污染物的耐受性亦随之增强。研究发现，沙蚕对多种环境污染物如重金属、多环芳烃等有较强的富集能力和污染耐受性［13］。深入开展沙蚕热休克蛋白研究，可从分子生物学水平探索其在沙蚕生理过程中的作用，为进一步分析重金属胁迫条件下该基因对细胞和机体的保护作用，以及建立以沙蚕为模式生物的海洋污染沉积质生物修复技术提供重要的参考依据。

本研究中，作者采用同源克隆及RACE技术首次从双齿围沙蚕体壁肌肉中克隆得到Hsp70基因，并进行了基因结构分析，同时构建系统发生树，将双齿围沙蚕Hsp70基因序列和其他已知Hsp70基因序列进行了聚类分析。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用双齿围沙蚕采自辽宁省盘锦市双台子河口，选取体质量为1.5～2.0 g的个体运回到大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室，于18℃水中暂养一周，每24 h更换海水1次。试验用海水取自大连市黑石礁海区，经沉淀、沙滤后贮存备用。试验海水的Cu(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)和 Cd(Ⅱ)的背景浓度分别为0.38、0.01、75.00、0.27、0.06 μg/L，盐度为31～32，pH为8.25±0.10，温度为 (18±0.5)℃。

RNAisoTMPlus、RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0、LA Taq®with GC Buffer、5'-Full RACE Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、DNA Ligaton Kit Ver.2.0(Code No.D6022)均购自TAKARA公司;EZ Spin Column DNA Gel Extraction Kit购自上海生工生物工程技术服务有限公司;其它试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取 研钵使用液氮预冷，取0.1 g双齿围沙蚕体壁肌肉，迅速放入预冷研钵中，加入适量液氮将组织研磨成粉末状，再按照RNAisoTMPlus试剂盒说明书提取总 RNA，最终溶于DEPC处理水中。经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检验总RNA的完整性，并使用紫外分光光度计测定其浓度［14-16］。将提取的总RNA于-80℃中保存备用。

1.2.2 引物设计 根据近源物种巨型管状虫Riftia pachyptila部分基因热休克蛋白Hsp70 CDS(GenBank登录号为FN860145)寻找保守区域设计简并引物 (表1)。以双齿围沙蚕总RNA为模板，反转录扩增出特异性片断，并对其进行序列测定和比对。根据得到的Hsp70基因片段设计3'RACE和5'RACE引物。

1.2.3 第一链合成及特异性片段扩增 取总RNA，按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒说明书合成cDNA及PCR反应。cDNA合成反应条件:30℃下反应10 min，42℃下反应60 min，70℃下反应15 min。同源克隆反应条件:94℃下预变性3 min;94℃下变性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸2 min，共进行30个循环;最后在72℃下延伸10 min。

表1 双齿围沙蚕Hsp70基因全长扩增引物设计Tab.1 Relative primers of Hsp70 gene cloning in Perinereis aibuhitensis

取5 μL PCR产物，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检验，再用EZ Spin Column DNA Gel Extraction Kit切胶回收试剂盒回收。回收后的产物用DNA Ligaton Kit Ver.2.0(Code No.D6022)载体连接并进行克隆，然后热转化至E.coli Competent Cells JM109中，涂布于平板上，于37℃下过夜培养，挑选阳性菌斑加至LB液体培养基 (含Amp)中培养16 h，送宝生物工程 (大连)有限公司进行测序。

1.2.4 RACE扩增 使用引物CTD553 F/R进行5'RACE和3'RACE扩增，引物信息详见表1。

1)5'RACE PCR扩增

按照LA Taq®with GC Buffer和5'-Full RACE Kit试剂盒说明书对总RNA进行去磷酸化处理和“去帽子”反应，并与5'RACE Adaptor连接后，反转录合成5'RACE的cDNA。采用巢式PCR方法扩增沙蚕Hsp70 5'端序列，设立M-MLV(-)阴性对照。Outer PCR反应使用引物CTD553 R173和5'RACE Outer Primer。Outer PCR反应条件:94℃下预变性3 min;94℃下变性30 s，65℃下退火30 s，72℃下延伸2 min，共进行30个循环;最后在72℃下延伸10 min。Inner PCR反应使用引物CTD553 R86 Primer和 5'RACE Inner Primer。Inner PCR反应条件同Outer PCR。使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒切胶回收，回收后的产物使用DNA Ligation Kit Ver.2.0中的连接酶，与pMD20-T Vector连接，热转化至E.coli Competent Cells JM109中，涂布于平板上，于37℃下过夜培养，挑选阳性菌落植菌并测序。

2)3'RACE PCR扩增

使用LA Taq®进行巢式PCR扩增，Outer PCR反应使用引物CTD553 F437 Primer和3'RACE Out-er Primer。Outer PCR反应条件:94℃下预变性3 min;94℃下变性30 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸2 min，共进行30个循环;最后在72℃下延伸10 min。Inner PCR反应使用引物CTD553 F534 Primer和3'RACE Inner Primer。Inner PCR反应条件同 Outor PCR。切胶回收及克隆测序方法同5'RACE。序列测定由 TAKARA公司完成，应用DNA Star软件将得到的序列拼接成完整的cDNA序列。

1.2.5 序列分析 用DNA Star软件翻译序列，获得编码序列的氨基酸序列，用Blast对推导的氨基酸序列进行同源性比对;用Clustal W和Mega 4.0进行系统进化分析;用ProtParam和DNA Star预测蛋白的理化性质、等电点和分子质量;用Tmhmm进行跨膜区分析，用SignalP进行信号肽预测，用ExPasy-ProtScale进行疏水性分析。

2 结果与分析

2.1 特异性片段扩增及RACE扩增

经过DNase I纯化处理后的总RNA用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测，可清晰地看到5S、18S和28S核糖体 RNA条带 (图 1)。结果显示，OD260nm/OD280nm为2.0左右，RNA有较高的完整性和均一性，无降解现象，符合基因克隆要求。

图1 双齿围沙蚕RNA的提取结果Fig.1 The total RNA from P.aibuhitensis

根据巨型管状虫Hsp70 CDS寻找保守区域设计引物CTD553 F/R，经PCR产物切胶后克隆测序得到574 bp的核苷酸序列 (图2)。通过优化PCR反应条件，3'RACE PCR扩增得到931 bp核苷酸序列 (图3-A)，5'RACE PCR克隆获得819 bp核苷酸序列 (图3-B)。经DNA Star软件进行序列拼接，得到全长为2 336 bp的双齿围沙蚕Hsp70 cDNA序列，并提交到 GenBank，登录号为HQ449186。

图2 Hsp70特异性片段扩增Fig.2 PCR amplification product of Hsp70 fragment

2.2 基因序列分析

序列分析显示，双齿围沙蚕Hsp70基因cDNA包括5'非翻译区88 bp、3'非翻译区286 bp和开放阅读框为1 962 bp，整个开放阅读框编码653个氨基酸。预测双齿围沙蚕Hsp70的相对分子质量为71 396，理论等电点为5.14，原子总数为10 036，分子式为C8645H13530N2378O2691S53。对Hsp70氨基酸序列的跨膜区进行分析，结果显示，Hsp70无明显跨膜结构，推测其可能是可溶性蛋白。根据ProtScale预测结果，Hsp70疏水性最大值为1.944，最小值为-3.133，整个多肽链中大多数氨基酸的分值较低，亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，故推测该蛋白可能为亲水性蛋白。氨基酸序列分析表明，Hsp70存在 IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL和 IVLVGGSTRIPKIQK 3个特征基序，并具有简并重复四肽GGMP。Hsp70氨基酸具有ATPase活性区，N端此活性区的保守性比C端更高。C末端具有以EEVD为特征的基序。

将双齿围沙蚕Hsp70序列提交到NCBI中，使用在线Blast软件进行同源性比较。结果表明，双齿围沙蚕Hsp70与褐牙鲆 Paralichthys olivaceus Hsp71同源性为78%，与斑鳟属Salmo salar Hsp70同源性为78%，与斑马鱼Danio rerio Hsp8同源性为78%，与脊尾白虾 Exopalaemon carinicaud同源性为77%，与文昌鱼Branchiostoma Hsp同源性为76%，与小鼠Mus musculus Hsp8同源性为76%，与长牡蛎Crassostrea giga Hsc71同源性为77%，与铃夜蛾属Helicoverpa Hsp70同源性为76%，与中华绒鳌蟹Eriocheir sinensis Hsp70同源性为77%。双齿围沙蚕Hsp70氨基酸序列通过GenBank数据库比较，经Clustal W多重序列比对分析，用Mega 4.1构建不同物种Hsp70基因的系统进化树 (图4)。从图4可见:双齿围沙蚕和庞贝蠕虫Alvienlla pompejana、可口革囊星虫Phascolosoma esculenta的Hsp70亲缘关系最近;稻飞虱Nilaparvata lugens和红火蚁Solenopsis invicta等昆虫聚为一簇;人Homo sapiens、野猪Sus scrofa、非洲象Loxodonta africana、火鸡Meleagris gallopavo、密西西比鳄Alligator mississippiensis、非洲爪蟾Xenopus laevis等脊椎动物为一簇。

图3 双齿围沙蚕Hsp70 PCR扩增产物电泳图Fig.3 Electrophoretogram of PCR amplified product of Hsp70 from P.aibuhitensis

图4 不同物种Hsp70基因的系统进化树Fig.4 The phylogenetic tree of Hsp70 gene in different species

3 讨论

Hsp70基因在不同生物体内均有分布，具有较高的保守性。Flynn等［17］研究表明，Hsp70氨基酸的一级结构近N端具有相对分子质量为45 000的高度保守结构域，该结构域具有ATPase活性;Hsp70氨基酸一级结构近C端具有相对分子质量为25 000的底物结合结构域，包括相对分子质量为15 000的p2夹层结构和相对分子质量为10 000的螺旋结构亚区。Hsp70家族具有 IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL和 IVLVGGSTRIPKIQK 3个特征基序［18-21］以及C末端具有EEVD特征基序。本试验中，克隆获得的双齿围沙蚕Hsp70序列也具有这些特征基序。

Hsp70 C末端的GGMP重复功能目前尚不清楚，相关资料表明，可能是分子伴侣因子的结合位点［22］，Piano等［23］认为只有 Hsc70 才有 GGMP 四肽重复。但Boutet等［18］发现，食用牡蛎Crassostrea gigas的Hsp70和Hsc70氨基酸序列C末端均含有GGMP重复。目前报道的Hsp70有的含有GGMP四肽重复［18，24］，有的则没有［23，25］。甚至同一物种会出现有或没有两种情况［22，26-27］。对本研究中克隆获得的双齿围沙蚕Hsp70序列结构进行分析发现，在其C末端具有GGMP四肽重复，对此末端重复功能还需要进一步研究。

根据不同物种Hsp70氨基酸序列的比对分析结果，进行系统进化分析。结果显示，稻飞虱和红火蚁等昆虫聚为一簇，人、野猪、非洲象、火鸡、密西西比鳄、非洲爪蟾等脊椎动物为一簇，双齿围沙蚕和庞贝蠕虫、可口革囊星虫的Hsp70亲缘关系最近。这与双齿围沙蚕生物进化情况相一致，可为今后环节动物门的系统学和进化研究提供重要的参考依据。

利用Hsp70作为分子生物标记，是目前海洋生物的一个热点研究领域［28-29］。Kilemade 等［30］研究发现，虹鳟鱼体内Hsp70的表达水平与水生环境中2，4-二氯苯胺的含量有关，认为水生生物体内Hsp70的表达水平可以作为水生环境毒性的指标。Veldhuizen-Tsoerkan等［31］将地中海贻贝Mytilus galloprovincialis放在污染水中，结果发现，经水体污染物诱导的贻贝Hsp高度表达。Snyder等［32］观察到贻贝和鲍鱼Haliotis rufescens暴露在高热和化学药品超标的水体中，其体内的Hsp70、Hsp90和Hsp60含量均发生显著变化。由此看出，Hsp70在防御应急中发挥一定的作用。笔者将进一步对其功能进行分析，以期对多毛类耐受环境污染的分子调控机制进行深入研究，为建立海洋沉积质污染早期生态风险测评和评价方法提供重要的参考依据。

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