韩瑞丽 王小丽 钟殿胜 赵娟 陈哲 孙琳琳 王竞 张金棒

肺癌主要分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC），其中80%-85%为NSCLC。尽管现代医学的诊疗技术已经有了相当的进展，采取了手术为主、放化疗等综合治疗手法，肺癌总的5年生存率仍只有13%-15%[1]。研究[2,3]发现，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）在50%-90%的NSCLC患者中高表达，参与肿瘤的血管新生、迁移和粘附过程，其扩增和突变已被认为是肺部肿瘤发生的主要机制之一。厄洛替尼（Erlotinib, Tarceva）是EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI），通过特异性结合在EGFR胞内酪氨酸激酶区域抑制EGFR活化而发挥抗瘤作用[4]。本研究探讨了NSCLC细胞系EGFR基因的表达水平及其抑制剂Erlotinib对NSCLC细胞系的毒性作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人NSCLC细胞系A549、H460、H157、H1299、H1792、CALU-1、H1650、H1975和HCC827购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection,ATCC）。RPMI-1640培养基、新生小牛血清购于GIBCO公司；Trizol Reagent购自美国Invitrogen公司；反转录试剂、SYBR Premix Ex Taq购自TAKARA公司，MTT试剂盒购于美国Promega公司，p-AKT、p-ERK、AKT、ERK、PTEN抗体均购于美国Cell Signaling Technology公司，GAPDH抗体购于美国Santa Cruz公司，二抗HRP-羊抗兔IgG、二抗羊抗鼠IgG购于北京中杉生物技术有限公司，PVDF膜购于美国Amersham Biosciences。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素配制成1640完全培养基，37oC、5%CO2、饱和湿度的培养箱中传代培养，0.125%胰酶消化传代，3 d-4 d传一代。所有实验均采用对数生长期细胞。

1.2.2 Real-time RT-PCR 用Trizol试剂提取处于对数生长期细胞总RNA，反转录mRNA为cDNA，使用realtime RT-PCR技术检测基因的表达情况。PCR引物序列为：EGFR：Forward：GCGTTCGGCACGGTGTATAA；Reverse：GGCTTTCGGAGATGTTGCTTC；参照基因GAPDH：Forward：GGAGTCAACGGATTTGGTCG；Reverse：CTGATTGGAGGGATCTCG，扩增长度为240 bp。PCR扩增体系20 μL，第一步：预变性 95oC、30 s、1个循环，第二步：PCR反应：95oC、5 s，60oC、34 s，40个循环。以GAPDH为内参照，2-ΔΔCT法计算EGFR基因表达差异。

1.2.3 MTT法检测细胞存活率 取对数生长期细胞，常规胰酶消化制成单……