张晓玲，周 芸，熊小凤，吴永江，栾连军

(浙江大学现代中药研究所，浙江杭州310058)

荷叶为睡莲科(NympHaeaceae)莲属(Nelumbo)植物莲的干燥叶，为药典收载品种，属药食两用植物。荷叶含生物碱、原花青素及多糖等成分。荷叶中所含生物碱为异喹啉类，如荷叶碱(Nunciferine)、亚美罂粟碱(Armepavine)、原荷叶碱(Pronuciferine)、N-去甲基荷叶碱(N-Nornuciferine)等，具有降脂减肥、抗病毒、抑菌、抗惊厥等药理作用［1］。原花青素是由(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素及(-)-表儿茶素没食子酸酯缩合而成的聚合多酚物质，具有降脂［2］、抗氧化［3］、抗肿瘤［4］、保护心肌缺血［5］、改善小鼠记忆［6］等药理作用。荷叶具有清热解暑，升发清阳，凉血止血功效，自古就是减肥佳品，《本草纲目》中有“荷叶服之，令人瘦劣”的记载。现代药理学研究表明，荷叶提物有降脂减肥、抗氧化和抑菌等功效，生物碱和多酚为主要有效成分［7］。卫生部批准的减肥保健食品中，有16个产品以荷叶为主要原料。已有文献报道多集中于荷叶生物碱，而对另一类重要成分荷叶原花青素研究较少。本实验以荷叶原花青素、荷叶碱为指标，优选一种适于工业化生产的荷叶生物碱、原花青素同时提取方法，以最大程度保证荷叶提取物的药效作用，为荷叶综合利用与深度开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荷叶药材 江西南昌济顺药厂提供，产地山东，批号Z001-20091009;香草醛 分析纯，中国上海双香助剂厂;浓盐酸 杭州禾德化工有限公司;原花青素对照品 天津尖峰天然产物研究开发公司，纯度≥95%;荷叶碱对照品 中国药品生物制品检定所，批号111566-200402;甲醇、乙腈 色谱纯，默克公司;磷酸、硫酸、冰醋酸 分析纯，杭州高晶精细化工有限公司;三乙胺 分析纯，天津市永达化学试剂有限公司。

DK-S24电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司;TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;高效液相色谱仪 Agilent 1200;PHS-3C精密pH计 上海日岛科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 荷叶碱与原花青素测定方法

1.2.1.1 荷叶碱测定方法 参照2010版药典收载荷叶项下方法，取荷叶粗粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，加热回流2.5h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，注入液相色谱仪，测定峰面积，外标法计算荷叶碱含量。色谱柱:Eelipse XDA-C18柱(4.6mm×250mm，5.0μm);流动相:乙腈-水-三乙胺-冰醋酸(27∶70.6∶1.6∶0.78);流速:1.0mL·min-1;柱温:35℃;检测波长 270nm;进样量:10μL。

1.2.1.2 原花青素测定方法 取荷叶约20g，精密称定，料液比1∶25(g/L)，70%乙醇，80℃回流提取三次，每次2.5h，滤过，合并滤液，加水定容至适当体积，测定溶液原花青素的含量。

原花青素的测定采用香草醛-甲醇溶液和盐酸显色法［8］，于10mL具塞试管中依次加入1mL不同浓度对照品溶液或样品溶液，3mL 3%香草醛-甲醇(W/V)溶液及1.5mL浓盐酸，混匀后于30℃水浴保温15min，在500nm下测定吸光度(以甲醇代替样品溶液作为空白对照)。

1.2.2 荷叶中荷叶碱、原花青素提取单因素实验设计单因素实验，分别考察提取溶液pH、酸的种类、磷酸浓度、提取时间、料液比、提取温度、提取次数对荷叶中荷叶碱和原花青素提取率的影响。

1.2.3 荷叶中荷叶碱、原花青素提取正交实验 在单因素实验的基础上，根据各单因素对两种有效成分的影响程度，选择磷酸浓度、料液比、提取时间三个因素进行正交实验设计，以确定最佳提取条件。L9(34)正交实验设计因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

2 结果与分析

2.1 荷叶含量测定结果

经测定，荷叶(批号Z001-20091009)中荷叶碱含量为0.45%，原花青素含量为2.5%(n=3)。荷叶碱色谱图见图1。

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 提取溶剂pH的影响 称取荷叶20g，以水为提取溶剂，用磷酸或氢氧化钠溶液调节 pH3、5、7、9、11，料液比 1∶15(g/L)，95℃加热提取二次，每次 1h，合并滤液，过滤，测定并计算原花青素和荷叶碱的提取率。结果见图2。

在实验设定的pH范围内，荷叶碱提取率随pH增大而下降，碱性环境下，提取率明显偏低。pH对荷叶原花青素的提取率无明显影响。选择酸性水溶液作为提取溶剂较为有利。

2.2.2 酸的种类的影响 称取荷叶20g，料液比1∶15(g/L)，95℃加热提取二次，每次 1h。提取溶剂分别为:0.1%(V/V)磷酸水、0.1%(V/V)醋酸水、0.1%(V/V)硫酸水。滤过，合并滤液，测定并计算原花青素和荷叶碱的提取率。结果见图3。

图1 荷叶碱对照品及荷叶提取液的HPLC图Fig.1 HPLC Chromatogram of nuciferine and sample solution

图2 提取溶剂pH对原花青素和荷叶碱提取率的影响Fig.2 Effect of pH on transfer rate of procyanidins and nuciferine

图3 酸种类对原花青素和荷叶碱提取率的影响Fig.3 Effect of acid on transfer rate of procyanidins and nuciferine

在0.1%酸浓度情况下，与醋酸水相比，硫酸水、磷酸水中荷叶碱提取率较高，对原花青素提取率影响不大。考虑到硫酸为易制毒试剂，管制较严，购买不便，可选择磷酸水作为提取溶剂。

2.2.3 磷酸浓度的影响 分别配制0.05%、0.1%、0.15%、0.20%、0.30%、0.40%(V/V)磷酸水溶液。称取荷叶20g，料液比1∶15(g/L)，加入不同浓度的磷酸水溶液，95℃加热提取二次，每次1h，滤过，合并滤液，测定并计算原花青素和荷叶碱的提取率。结果见图4。

图4 磷酸浓度对原花青素和荷叶碱提取率的影响Fig.4 Effect of the volume fraction of acid on transfer rate of procyanidins and nuciferine

在0.05%至0.4%(V/V)磷酸水浓度范围内，随酸浓度增加，荷叶碱、原花青素的提取率逐渐提高，在0.2%～0.3%左右达到最大，随后原花青素提取率、荷叶碱提取率均随着酸浓度升高提取率下降。

2.2.4 提取时间的影响 称取荷叶20g，料液比1∶15，0.1%(V/V)磷酸水溶液，95℃加热提取二次，提取时间分别为0.5、1、2、3h。滤过，合并滤液，测定并计算原花青素和荷叶碱的提取率。结果见图5。

图5 提取时间对原花青素和荷叶碱提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on transfer rate of procyanidins and nuciferine

提取1h后，溶液中原花青素、荷叶碱基本达到平衡，提取率基本不再增加。考虑到原花青素易氧化及热稳定性，提取时间宜控制在1～2h内。

2.2.5 料液比的影响 称取荷叶20g，加0.1%(V/V)磷酸水溶液，95℃加热提取二次，料液比分别为 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30(g/L)，滤过，合并滤液，测定并计算原花青素和荷叶碱的提取率。结果见图6。

图6 料液比对原花青素和荷叶碱提取率的影响Fig.6 Effect of material-liquid ratio on transfer rate of procyanidins and nuciferine

原花青素、荷叶碱的提取率随着料液比的增大而增大，至1∶20(g/L)以上时，提取率升高速度减慢。考虑到溶剂消耗、生产耗能及后续浓缩，料液比宜控制在 1∶25(g/L)以内。

2.2.6 提取温度的影响 称取荷叶20g，料液比1∶15(g/L)，0.1%(V/V)磷酸水溶液，加热提取二次，每次1h，提取温度80、90、95、100℃，滤过，合并滤液，测定并计算原花青素和荷叶碱的提取率。结果见图7。

图7 提取温度对原花青素和荷叶碱提取率的影响Fig.7 Effect of extraction temperature on transfer rate of procyanidins and nuciferine

提取温度在95～100℃范围内，原花青素、荷叶碱提取率渐趋平稳，考虑控制提取温度在95～100℃之间。

2.2.7 提取次数的影响 称取荷叶20g，料液比1∶15(g/L)，0.1%(V/V)磷酸水溶液，95℃加热提取，每次1h，提取次数分别为 1、2、3、4、5 次，滤过，合并提取液，测定并计算原花青素和荷叶碱的提取率。结果见图8。

图8 提取次数对原花青素和荷叶碱提取率的影响Fig.8 Effect of extraction times on transfer rate of procyanidins and nuciferine

荷叶碱、原花青素提取率总体上随提取次数增加而增加，在3～4次后基本达到平衡。考虑到提取次数越多，在工业生产中会造成溶剂和能源的浪费，所以考虑选择提取2～3次。

2.3 正交实验

2.3.1 样品制备 按照正交表1安排实验，称取荷叶药材20g置于圆底烧瓶中，加入提取溶剂，水浴加热回流提取二次，趁热过滤提取液，定容至一定体积，测定原花青素与荷叶碱含量，计算提取率。结果见表2，方差分析见表3～表4。

由表3～表4分析可知，各因素对荷叶中荷叶碱和原花青素提取率影响主次关系均为:料液比＞磷酸浓度＞提取时间。磷酸浓度(A)对原花青素提取率影响较小，对荷叶碱的提取率影响较大，具有显著性;料液比(B)对原花青素和荷叶碱的提取率均有显著影响;提取时间对两者的影响均不显著。综合两种有效成分提取率确定优化工艺条件为A3B3C2，即磷酸浓度为0.3%、料液比1∶25(g/L)、提取时间为1.5h。

表2 荷叶提取正交实验结果Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

表3 原花青素正交实验结果方差分析表Table 3 Analysis of variance by procyanidins

表4 荷叶碱正交实验结果方差分析Table 4 Analysis of variance by nuciferine

2.3.2 验证实验 按照A3B3C2最佳工艺条件进行三次重复实验，结果表明，原花青素的提取率为89.2%，荷叶碱的提取率为69.9%。

3 结论

在磷酸浓度为0.3%、料液比1∶25(g/L)、提取时间为1.5h时，原花青素的提取率可达到89.2%，荷叶碱的提取率可达到69.9%，此优化条件能明显提高荷叶生物碱的提取率。原花青素在碱性条件下极易降解，在弱酸性条件下比较稳定［9］，因此采用酸水提取法提取荷叶中的两类有效成分，具有提取效率高、工艺简便、成本低的优势，适合于工业化大生产应用。

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