王金东，刘寿桃，林焕彩，郝高峰，乔永刚

(1.深圳市妇幼保健院口腔疾病防治中心，广东 深圳 518048；2.中山大学光华口腔医学院口腔预防科中山大学口腔医学研究所，广东 广州 510055)

稳定存在于唾液中的蛋白质达90多种，唾液蛋白可通过多种途径影响龋病的发生发展，其含量和组成可随年龄、机体的健康状况而发生改变[1]。过往调查表明我国儿童乳牙龋患病率高且存在两极分化倾向，儿童患龋程度存在明显差异[2]，但目前尚缺乏基于流行病学调查基础的不同患龋状况儿童与唾液蛋白中关键组份的定量研究报道。本研究定量分析了不同患龋程度儿童唾液中总蛋白和部分唾液蛋白组份的含量，以期探讨它们之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以本课题组2005年广州从化市儿童龋病流行病学调查所得数据库为基础，采用单纯随机抽样法选取4～5岁儿童80名，分为无龋组(Caries free group，dmft=0)40人，高龋组(Caries susceptible group，dmft≥5)40人，每组男女各半(龋病诊断按世界卫生组织1997年推荐的《口腔健康调查基本方法》第四版中的标准)。所有儿童及家长均知情并同意参加该项研究。排除有全身疾患者。

1.2 方法

1.2.1 总蛋白含量测定 上午9：00～11：00，采用吐取法收集受激全唾液约3 ml(混有血迹者弃之)，将唾液样本收集至无菌离心管，冰存4 h内送回实验室。4℃离心(10 000 r/min，60 mm)15 min，取上清-80℃保存备用。利用双金鸡纳酸的双缩脲反应，采用分光光度法测定，使用Tecan Sunrise酶标仪(瑞士TECAN)。

1.2.2 唾液蛋白电泳分析 采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳法(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)对 唾液样本中的蛋白质进行分离。分离条件：浓缩胶120 V，100 mA；分离胶180 V，100 mA。考马斯亮蓝R-250染色，Ultra-lum Omega多功能化学发光成像系统扫描，1D Scan Ex专业凝胶图像分析软件测定目标条带。采用宽分子量蛋白质marker(美国Sigma)。

1.3 统计学方法 数据经SPSS13.0统计软件处理，采用两组独立样本t检验，设α=0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同龋易感儿童唾液总蛋白含量 男、女合计唾液中总蛋白含量均为高龋组低于无龋组(P＜0.05)，不同性别儿童总蛋白含量两组间差异无统计学意义(P=0.518)。

2.2 SDS-PAGE电泳分析结果 经15%SDS-PAGE检测发现，10 000、28 000、38 000、56 000和77 000蛋白百分含量高龋组均高于无龋组(P＜0.05)，14 500蛋白百分含量两组间差异无统计学意义(见表1，图1)。

表1 两组儿童唾液各蛋白组分百分含量比较(IA/μg，±s)

表1 两组儿童唾液各蛋白组分百分含量比较(IA/μg，±s)

组别高龋组无龋组t值P值例数40 40--10 000蛋白29.22±11.46 23.19±11.77 2.324 0.023 14 500蛋白8.96±4.28 7.48±4.55 1.501 0.137 28 000蛋白19.17±11.84 13.00±6.19 2.924 0.005 38 000蛋白23.95±9.00 18.66±7.69 2.824 0.006 56 000蛋白87.10±39.21 61.76±26.24 3.398 0.001 77 000蛋白12.50±7.73 8.71±4.28 2.711 0.009

图1 唾液蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图

3 讨论

本研究发现高龋儿童唾液中总蛋白含量低于无龋儿童，不同性别儿童之间唾液中总蛋白含量差异无统计学意义。对4～5岁不同龋易感儿童刺激性全唾液总蛋白含量的研究鲜见报道，本研究结果与Tulunoglu等[3]对7～10岁儿童的研究一致。唾液中总蛋白含量随年龄呈明显的上升趋势[4]。其与龋病的具体相关关系应深入研究。

本研究中唾液蛋白SDS-PAGE凝胶电泳可分离出7～14条可分析条带，平均每个样品可分离出10条，其中10 000、14 500、28 000、38 000、56 000、77 000位置的6种不同分子量蛋白条带稳定出现。高龋组与无龋组比较条带数目较为相似，Banderas-Tarabay等[5]和Shiba等[6]的研究结果与本研究相似。Schwartz等[7]对成人全唾液蛋白用SDS-PAGE分离出了34条条带，本研究分离的蛋白条带数目与之相比较少，可能与以下原因有关：1)目标人群不同，种族和年龄不同均可能导致唾液蛋白组成发生质和(或)量的变化；2)电泳条件不同，本研究选用Mini型垂直电泳系统，凝胶厚度0.75 mm；3)条带分析标准不同，本研究只统计用1D Scan Ex凝胶图像分析软件可以分析的扫描条带，而有的学者是视觉观察与软件分析相结合，观察到的条带均计算在内。

研究结果显示，刺激性全唾液中10 000、28 000、38 000、56 000、77 000蛋白的百分含量均为高龋组高于无龋组；14 500蛋白的百分含量两组间差异无统计学意义。

相对分子量为10 000的唾液蛋白是碱性富脯蛋白，28 000位置的为酸性富脯蛋白，56 000位置则有相当一部分为糖基化富脯蛋白。富脯蛋白可达受激唾液蛋白总量的10%，根据其糖基化程度分为碱性富脯蛋白、酸性富脯蛋白、糖基化富脯蛋白等[8]。本研究结果显示10 000和28 000蛋白的百分含量高龋组均高于无龋组。胡云明等[9]用高效疏水液相色谱法对不同龋易感人群腮腺唾液蛋白检测亦得出相同结果。Ayad等[10]利用高效液相色谱法对高龋组和无龋组成人腮腺液中的富脯蛋白进行了分离分析，未发现两组间有差异。与本研究的结果不符，具体原因有待进一步的研究。

唾液中相对分子量为38 000的蛋白是SIgA，本研究结果显示高龋组SIgA百分含量高于无龋组，提示致龋菌处于活跃状态时，刺激机体免疫系统，致SIgA分泌增多，从而增强对牙体组织的保护作用，抑制龋病的发展。吴晓霞等[11]用非竞争性生物素-抗生物素酶联免疫吸附法对4～5岁儿童非刺激性全唾液中SIgA浓度与龋病关系进行分析，认为高龋儿童SIgA百分含量低于无龋组。本研究结果与吴晓霞等[11]的研究不符，可能与检测方法、样本量大小、样品处理方式等因素有关。

相对分子量为56 000位置的是唾液α-淀粉酶及其同功酶和糖基化富脯蛋白的混合蛋白，其中主要是唾液α-淀粉酶及其同功酶。在根面龋的研究中发现α-淀粉酶可以抑制牙体组织的脱矿[12]。景娟等[13]研究发现20～30岁的高龋人群α-淀粉酶百分含量高于无龋组，本研究结果与之一致。

本研究认为14 500蛋白百分含量两组间差异无统计学意义。溶菌酶分子量为14 500，是宿主口腔先天性防御系统的关键组份。本研究结果与Stuchell等[7]采用免疫扩散法对成人检测的结果一致。Bai等[14]对42～54个月幼儿的研究则发现高龋儿童唾液溶菌酶的含量比无龋儿童高。出现不同的结果可能与测定方法有别相关，本研究采用SDS-PAGE凝胶电泳，Bai等[14]利用比浊法进行检测。虽然在体内和体外实验中均表明溶菌酶可以明显地抑制致龋菌的生长，但是唾液中溶菌酶含量与不同龋易感性的关系尚不明确。

高龋儿童刺激性全唾液中77 000蛋白的百分含量高于无龋组。唾液中乳铁蛋白的分子量为77 000，乳铁蛋白通过与铁形成螯合物夺取细菌生长必需的铁离子而抑制细菌生长，亦能直接杀灭部分细菌。本研究结果与Sikorska等[15]多位学者的研究相符，其对15岁组人群研究发现，龋易感性与唾液中乳铁蛋白含量高度相关，龋面值越高，乳铁蛋白百分含量也越高[15]。粘附能力强的细菌可刺激唾液中乳铁蛋白的分泌，乳铁蛋白含量的增加又可协同唾液中其他蛋白抑制细菌的致龋作用。符合机体的生理性应激机制，提示乳铁蛋白在乳牙龋病发生和发展中起重要作用。

乳牙龋的危害十分严重，唾液蛋白中关键组分在乳牙龋病的发生、发展中起着重要作用。今后应着重研究各蛋白组分在龋病发生发展中所起的具体作用，以期明确它们与乳牙龋的关系。

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