谭晓秋,陈桂兰,李 涛,毛 亮,井上勋,杨 艳,曾晓荣

(泸州医学院医学电生理省部共建教育部重点实验室,四川泸州 646000)

近年来,小电导钙激活钾通道(small conductance calcium activated potassium channels,SK2)在人心房肌细胞上发现并证明在心肌细胞复极化过程中扮演着重要角色[1]。SK2通道在心房与心室表达的不均一性以及与胞内钙离子和细胞膜钙通道的耦联关系提示在某些房性心律失常(如心房颤动等)发生发展中起重要作用,也可能成为这些疾病的治疗靶点[2-4]。异源表达离子通道在工具细胞如HEK293等,已成为目前研究离子通道功能活动和药物筛选的主要方法之一。因直接进行RT-PCR无法得到该基因(KCNN2)的编码区全长序列,本研究旨在采用Overlapping PCR(重叠PCR)法进行KCNN2基因全长序列的扩增和表达质粒的构建。

1 材料与方法

1.1 实验标本、试剂和仪器

用于本研究的实验标本来源于一例先天性心脏病患者体外循环手术常规切除的右心耳组织。主要试剂包括总RNA提取试剂盒(上海华舜公司)、逆转录试剂盒与SYBR Green I定量试剂盒(TOYOBO公司)、胶回收试剂盒(北京天根公司)、质粒提取试剂盒、pMD18-T载体、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、5-溴-4 氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-a-D-galactopyranoside,X-gal,TAKARA公司),焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)、LB培养基(上海生工公司),大肠杆菌DH5α本实验室自己保存,其余试剂为国产分析纯。主要实验仪器有实时荧光定量PCR仪(MJ公司)、紫外分光光度仪(Nanodrop公司)、超速低温离心机(Heraeus公司)、Millipore超纯水仪(Millipore公司)等。

1.2 总RNA提取和逆转录

进行人心房肌总 RNA提取,得到的总 RNA-80℃保存备用。取总RNA约1.5 μ g,构建逆转录反应体系 :Total RNA 1.5 μ g 、ReverTra Ace 1 μ l、5 ×RT Buffer 4 μ l、dNTP Mixture 2 μ l、RNase Inhibitor 1 μ l、Random Primer 1 μ l、RNase Free H2O up to 20 μ l。获得的cDNA-20℃保存备用。……