马 晶,丁诚实,余 鸿

(1.枣庄职业学院医学系,山东枣庄 277800;2.枣庄学院生命科学学院,山东 枣庄 277160;3.泸州医学院 组胚教研室,四川 泸州 646000)

当归是国药精华,其味甘而重,专能补血;其气轻而辛,又能行血。由于其作用广泛、副作用小,使其在妇产科临床上具有独特的优势。研究表明当归可以减弱低氧时神经元的变性[1],但其如何对抗神经系统的损伤机制还有待研究。近年来研究发现,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)具有类似血管源性的神经保护和神经营养作用,但VEGF是否也参与宫内低氧新生大鼠的神经系统的改变目前尚不确定。本实验在前期的研究基础[2]上进一步延长低氧时间(低氧5 d),观察神经元及神经胶质细胞的变化,研究当归对其是否有干预作用并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SD雌、雄大鼠各15只(220～260 g)由泸州医学院动物实验中心提供(一级合格动物,许可证号:川实动管质第17号);大鼠神经特异性烯醇化酶(neurone specific enolase,NSE)mR NA、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)mR NA、VEGF mRNA原位杂交检测试剂盒,3,3'-二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自武汉博士德生物工程公司;原位杂交用焦碳酸二乙酯(DEPC)由第四军医大学试剂公司提供;250 g/L的当归注射液(购自武汉大学中南医院,生产批号:070823)。三气培养箱购自美国REVCO COMPANY;切片机为德国莱卡产品;OLYMPUS Ax-70显微成像系统购自日本OLYMPUS光学仪器有限公司;Image-Pro Plus 6.0图像分析系统为Media Cybernetics公司产品。

1.2 动物及分组

雌大鼠分别与雄大鼠合笼配种,次日晨见阴栓记为大鼠怀孕0 d,孕鼠随机均分为对照组、低氧组和当归组。

1.3 宫内低氧动物模型制备

参照本实验小组前期制作的宫内低氧模型[3],但延长低氧时间。当归组孕鼠自孕第l4天开始,每天下午2∶00经尾静脉注射250 g/L的当归注射液8 ml/kg(孕第14～20天,连续7 d),1 h后放入设置好的三气培养箱(氧体积分数130ml/L,温度25℃ ,二氧化碳体积分数0.4～0.6ml/L)内低氧2 h,连续低氧5 d(孕第14～18天),第 19、20天仍给予当归注射液,但不低氧。低氧组用9 g/L盐水代替当归注射液,其余同当归组。对照组不低氧,余同低氧组。

1.4 取材、石蜡切片与原位杂交

每只孕鼠分娩当天随机选取新生大鼠4只,每组得新生鼠20只,取新生大鼠脑、40 g/L多聚甲醛固定60 min、石蜡包埋(试剂中含1 ml/L的DEPC)、海马冠状切面切片。切片作NSE mRNA、GFAP mRNA、VEGF mRNA 原位杂交,切片常规脱水、透明、封片。每张切片在400倍下用OLYMPUS Ax-70显微成像系统对海马CA3区拍照。

1.5 图像分析

采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统,分析原位杂交图并统计其积分光密度(IOD)值。

1.6 统计学处理

采用SPSS 16.0软件包完成数据分析。数据采用均值±标准差(±s)表示,组间比较用LSD法检验。

2 结果

2.1 NSE mRNA原位杂交染色结果

NSE mRNA原位杂交反应阳性细胞细胞质被染为棕黄色,胞质中央为卵圆形或圆形空泡。主要分布锥体细胞层、分子层。低氧组NSE mRNA原位杂交反应阳性细胞的分布与对照组相似,但阳性细胞较对照组染色减弱、数量减少,其积分光密度值均减小(P＜0.05)。当归组NSE mRNA原位杂交反应阳性细胞分布与对照组相似,但较低氧组染色增强、数量增多,其积分光密度值增大(P＜0.05,图1,表1)。

2.2 各组新生鼠海马CA3区GFAP mRNA原位杂交结果

GFAP mRNA原位杂交阳性细胞胞质染为棕黄色,主要分布于锥体细胞层、分子层和多形细胞层。对照组阳性细胞浅染,数量少。低氧组阳性细胞染色深,数量较对照组增多,尤其以分子层变化明显。当归组阳性细胞较低氧组染色明显减弱,数量明显减少(P＜0.05,图2,表1)。

2.3 各组新生鼠海马CA3区VEGF mRNA原位杂交结果

VEGF mRNA原位杂交阳性细胞胞质染为棕黄色,阳性细胞主要分布于锥体细胞层,细胞大而圆。对照组分布较集中,阳性细胞染色较浅。低氧组阳性细胞较对照组染色加深,数量增多,分子层和多形细胞层出现较多阳性细胞。当归组阳性细胞较低氧组染色加深,阳性细胞数量明显增多,尤以分子层最为明显(P＜0.05,图3,表1)。

Fig.1 NSE mRNA positive cells in hippocampal CA3 area of neonatal rat(ISH ×400)

Fig.2 GFAP mR NA positive cells in hippocampal CA3 area of neonatal rat(ISH ×400)

Fig.3 VEGF mRNA positive cells in hippocampal CA3 area of neonatal rat(ISH ×400)

Tab.1 IOD of NSE mRNA,GFAP mRNA,VEGF mRNA positive cell(±s,n=20)

Tab.1 IOD of NSE mRNA,GFAP mRNA,VEGF mRNA positive cell(±s,n=20)

NSE:Neurone specific enolase;GFAP:Glial fibrillary acidic protein;VEGF:Vascular endothelial growth factor;IOD:Integrated optical density*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs hypoxia

Group NSE GFAP VEGF Control 83.85±5.52 7.24±1.78 63.62±6.08 Hypoxia 52.18±4.98*16.78±4.02*75.80±5.55*Angelica 72.25±3.29*#9.78±2.79#89.15±9.90*#

3 讨论

本实验结果发现,宫内低氧(130ml/L)连续5d(2 h/d)后海马CA3区NSE mRNA原位杂交阳性物质表达比对照组明显减弱,阳性细胞减少,积分光密度值减小,提示胚胎海马的神经元出现了坏死和/或凋亡,导致神经元数量减少,低氧对神经元起到了损伤作用。本实验原位杂交结果显示低氧组海马CA3区GFAP mRNA阳性细胞数量和染色均较对照组明显增多,说明低氧刺激了该区胶质细胞增生,其可能与胶质细胞参与了神经系统的修复相关,是神经系统对低氧的适应性反应。而当归组GFAP mRNA较低氧组减少,说明当归在一定程度上减弱了由于低氧导致的该区胶质细胞的增生。在神经系统中,胶质细胞的数量是神经元的数十倍,而神经元损伤时,胶质细胞增生、肥大,形成胶质瘢痕予以修复损伤区域。结合本实验结果,可见胶质细胞在神经系统低氧修复时起了重要作用。实验中低氧组VEGF mRNA较对照组增多,当归组VEGF mRNA较低氧组进一步增多,说明低氧可上调VEGF mRNA的表达,而当归注射液可进一步上调VEGF mR NA的表达。结合NSE mRNA结果分析,说明低氧后VEGF mRNA的上调表达所产生的抗凋亡等神经保护作用还不足以抵抗由于持续5 d(2 h/d)的宫内低氧(130 ml/L)导致的神经元损伤作用,从而使低氧组NSE mRNA的IOD值较对照组减小;而当使用当归注射液后使VEGF mRNA的表达进一步上调,从而进一步增强了VEGF的神经保护作用,使当归组NSE mRNA的IOD值较低氧组增大。有研究表明VEGF大量表达有利于大脑损伤的修复、功能的完善,其机制可能与促进血管发生、保护神经组织、促进胶质细胞增生及修复等作用密切相关;大量的VEGF表达增加了脑血管通透性,使用VEGF受体阻滞剂反而减轻了脑组织的急性兴奋性损伤[4],这可能和VEGF的量及出现在损伤后的时间有密切关系。

现代研究发现,当归属根中提取的前胡素、前胡醇衍生物等具有高活性的神经保护作用,通过多种机制减少氧化应激引起的细胞损伤。结合本实验结果,推测低氧刺激产生的神经保护作用可能与当归对内源性VEGF的激活有关。

[1]Wu Y L,Zhao H X,Yu H.Protective effect of Angelica sinensis on cerebral neurons from rat embryos under hypoxia[J].Neural Regen Res,2007,2(1):46-49.

[2]Yue H S,Chen X D,Zhong X M,et al.Effect of Angelica sinensis on neural stem cell proliferation in neonatal rats following intrauterine hypoxia[J].Neural Regen Res,2008,3(7):733-736.

[3]钟小明,陈旭东,钟 梅,等.宫内缺氧对幼年大鼠神经干细胞增殖及学习记忆能力的影响[J].实用儿科临床杂志,2008,23(2):146-147,156.

[4]Ryu J K,McLarnon J G.VEGF receptor antagonist Cyclo-VEGI reduces inflammatory reactivity and vascular leakiness and is neuroprotective against acute excitotoxic striatal insult[J].J Neuroinflammation,2008,5:18.