郝卯林,戴雍月,倪世容,汪大望,李素娟,金可可△

(1.温州医学院病理生理教研室,2.附属第一医院内分泌科,浙江温州325035;3.中国人民解放军第八二医院内分泌科,江苏 淮安 223001)

近年资料表明,糖尿病慢性并发症的发生和发展不仅与整体血糖控制水平密切相关,也与血糖波动性有关。血糖波动性越大,糖尿病慢性并发症的发生率越高,预后越差[1]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者常见而严重的慢性并发症,高血糖导致的肾脏细胞凋亡参与糖尿病肾病的发生、进展[2]。我们前期研究发现,糖尿病大鼠血糖明显波动可加速肾小管上皮细胞凋亡[3]。业已证实,血糖波动更容易引发氧化应激[4];JNK为丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中的重要成员,JNK信号通路是导致细胞凋亡的重要信号通路。研究表明,高水平的活性氧能直接激活JNK,也能通过抑制磷酸酶、活化MAP3Ks等间接激活JNK[5]。因此,本研究旨在观察JNK信号转导通路在波动性高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡中的作用,以探讨波动性高糖比稳定性高糖引起更严重的肾小管上皮细胞凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)及枸橼酸钠分析纯购于美国sigma公司;普通速效胰岛素(400 U/10 ml)购于江苏万邦生化有限公司;强生(Johnson)稳步倍加血糖仪及试纸购于美国强生;MDA和SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所;TUNEL试剂盒购自Hoffmann-La Roche有限责任公司;非生物素标记的即用型免疫组化二抗试剂盒购自武汉博士德生物科技有限公司;兔抗大鼠JNK、p-JNK单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;兔抗大鼠Nox4购自北京博奥森生物科技有限公司;PVDF膜购自美国Bio-Rad公司。

1.2 实验动物及模型制备

180～220 g雄性SD大鼠由本校实验动物中心提供,随机取10只作为正常对照(A),其余采用STZ按65 mg/kg腹腔注射诱发糖尿病,注射STZ 72 h后,尾部取血,测空腹血糖和刺激大鼠膀胱测尿糖,血糖＞16.7 mmol/L,尿糖3个+以上为造模成功,随机取DN大鼠分为稳定高血糖组(B)和血糖波动组(C),C组每天定时腹腔注射速效胰岛素,并错时给予葡萄糖,造成1 d中血糖浓度大幅度波动模型(图 1)。12周 C组每天血糖波动模式相似,且HbAlc在C组10.50%±0.69%与B组10.13%±0.96%比较无显著性差异,提示波动性高血糖造模成功。12周后取肾脏组织用于指标测定。

Fig.1 Blood glucose variation curve of 3 groups

1.3 氧化应激指标测定

取肾组织匀浆,化学比色法测定SOD活性及MDA含量,操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 TUNEL法检测肾脏细胞凋亡

检测方法严格按说明书操作。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞。计算5个高倍视野(×400)下的凋亡细胞数,以凋亡细胞/100个细胞表示凋亡指数(apoptosis index,AI)。

1.5 免疫组化检测肾脏Nox4和JNK蛋白表达

采用SABC法,DAB显色。检测方法严格按说明书操作。光镜下观察,阳性反应为细胞浆呈棕黄色染色,不染色者为阴性。

1.6 Western blot检测肾脏JNK蛋白表达

细胞经相应处理后加裂解液,超声裂解,吸取上清液,用BCA法测定蛋白质浓度。取10 μ g蛋白上样于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳并转印至PVDF膜上,封闭1.5 h,加入1∶1 000稀释的P-JNK、JNK 抗体和GAPDH抗体(内参),4℃过夜。Ⅰ抗反应结束后,加1∶3 000稀释的辣根过氧化物酶标记的特异性Ⅱ抗室温孵育2 h,ECL试剂显色并曝光成像,扫描并分析吸光度。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 波动性高血糖对糖尿病大鼠的肾脏氧化应激的影响

2.1.1 三组大鼠肾组织匀浆SOD活性和MDA含量的比较 与A组比较,B组和C组SOD活性明显降低,且C组低于B组(P＜0.01);B组和C组MDA含量明显升高,且C组高于B组(P＜0.01,表1)。

Tab.1 Comparison of the SOD activity andMDA content in renal tissue homogenate among different groups(±s,n=10)

Tab.1 Comparison of the SOD activity andMDA content in renal tissue homogenate among different groups(±s,n=10)

SOD:Soperoxideclismutase;MDA:Malonaldehyde*P＜0.05,**P＜0.01 vs normal control group;##P＜0.01 vs stable high blood glucose group

Group SOD(NU/ml) MDA(nmol/ml)Normal control 28.11±4.16 1.87±0.45 Stable high blood glucose 15.51±2.43** 3.72±0.74*Fluctuant high blood glucose7.77±1.61**##5.59±1.08**##

2.1.2 三组大鼠肾组织Nox4蛋白表达的比较 与A组和B组比较,C组肾小管上皮细胞Nox4蛋白表达明显增强(图2见彩图页Ⅳ)。

2.2 波动性高血糖对糖尿病大鼠的肾脏细胞凋亡的影响

A组肾小管上皮细胞几乎未见凋亡细胞,B组(8.36%±2.66%)和C组(12.98%±2.81%)的肾小管上皮细胞凋亡数明显增多,且C组较B组增多更加明显(P＜0.01,图3、4,图3见彩图页Ⅳ)。

Fig.4 Apoptotic cell was detected by TUNEL in kidney of rats

2.3 波动性高血糖对糖尿病大鼠肾脏JNK蛋白表达的影响

免疫组化结果显示,A组几乎未见p-JNK蛋白表达,B组和C组肾小管上皮细胞p-JNK蛋白表达均明显增强,且C组较B组表达更强(图5见彩图页Ⅳ)。Western blot检测结果表明,B组和C组的JNK蛋白和p-JNK蛋白表达量均较A组明显增高,且C组高于B组(图6)。

Fig.6 p-JNK protein level was detected by Western blot in kidney of rats

3 讨论

糖尿病患者的高血糖主要有两种形式,包括慢性波动性高血糖与慢性持续性高血糖。随着糖尿病患者多项大型临床试验的开展以及对其病理生理机制的深入研究,目前多数研究认为,糖尿病慢性并发症的发生与发展不仅与血糖整体水平升高有关,也与血糖的波动性密切相关。研究发现,相同的HbA1c值可以存在不同的血糖状况,具有相近HbA1c值的患者中,血糖波动较大者发生慢性并发症的风险更大[6]。本实验中,我们通过对糖尿病大鼠12周模型的研究,发现糖尿病血糖波动组肾脏细胞凋亡指数是持续高血糖组的1.55倍,凋亡尤其发生在肾小管上皮细胞和间质细胞,因此进一步证实在糖化血红蛋白水平相似的糖尿病动物中,血糖的波动幅度增大可加重肾小管上皮细胞的凋亡程度,研究已表明,肾组织细胞凋亡是DN的发生发展中一个重要的早期事件。

慢性持续性高血糖症会导致过高的糖化反应和氧化应激的形成,而最近发现糖尿病发生的急性血糖波动是触发氧化应激反应的一个额外因素[7]。业已证实,氧化应激是造成细胞凋亡的重要环节。本研究表明,糖尿病稳定高血糖组和波动性高血糖组的肾脏氧自由基清除剂SOD活性降低,脂质过氧化产物MDA含量增加,且波动性高血糖组的上述改变更加明显,说明糖尿病时波动性高糖引发的肾脏氧化应激反应较稳定性高血糖增强。Yaqoob等[8]的早期研究提示,糖尿病发生的氧化应激对肾小管的损伤可能先于肾小球损害。我们进一步研究也发现,波动性高血糖大鼠的肾小管Nox4表达较稳定高血糖组更加明显,细胞凋亡数也相应增加。Nox4是NADPH氧化酶的一种重要亚型,主要在成年肾组织表达,糖尿病时活性氧族(ROS)增高的来源有很多,其中NADPH氧化酶被认为是ROS产生的最重要机制,能够将分子氧通过单电子还原产生过氧化自由基,并以此为基础形成一系列ROS产物。高血糖可激活细胞内PKC信息转导途径从而活化NOX,而NOX抑制剂可有效抑制糖尿病大鼠肾组织中ROS的产生,减少蛋白尿和改善肾组织病理改变,延缓DN的发生发展[9]。以上结果提示,与稳定性高血糖比较,波动性高血糖状态下的肾小管上皮凋亡增加与氧化应激水平增高有密切关系。

体内外实验均证实,氧化应激能导致JNK激活,JNK又是细胞凋亡发生过程中的重要调控者。一般认为,JNK被磷酸化激活后,能通过转录依赖或转录非依赖机制调控下游靶基因的表达或靶蛋白的活性而介导细胞凋亡。研究发现,JNK被活化后可从胞质中转位入核,通过磷酸化激活c-Jun、c-Fos等转录因子而调节凋亡相关靶基因的转录表达。活化的JNK也可留在胞质内,催化Bcl-2家族抗凋亡蛋白磷酸化而失去活性,促进细胞凋亡的发生[10]。本研究发现糖尿病持续高血糖组和波动高血糖组肾小管上皮细胞胞质JNK蛋白的磷酸化水平均明显高于正常对照组,且波动高血糖组较持续高血糖组变化更为明显,这与其氧化应激水平和凋亡程度增加的趋势一致,提示血糖波动可能作为一种刺激信号,会引发较单纯高血糖更加严重的氧化应激反应,通过激活JNK,进而促进细胞凋亡。

[1]王先令,陆菊明.血糖波动对糖尿病预后及其慢性并发症发生发展的影响[J].国外医学内分泌学分册,2005,25(3):169-173.

[2]Kumar D,Zimpelmann J,Robertson S,et al.Tubular and interstitial cell apoptosis in the streptozotocin-diabetic rat kidney[J].Nephron Exp Nephrol,2004,96(3):e77-88.

[3]金可可,林艳红,王万铁,等.血糖波动对糖尿病大鼠肾小球内皮细胞和肾小管上皮细胞凋亡的影响[J].中国病理生理杂志,2007,23(3):570-573.

[4]Piconi L,CorgnaliM,Da Ros R,et al.The protective effect of rosuvastatin in human umbilical endothelial cells exposed to constant or intermittent high glucose[J].J Diabetes Complications,2008,22(1):38-45.

[5]Nakano H,Nakajima A,Sakon-Komazawa S,et al.Reactive oxygen species mediate crosstalk between NF-κ B and JNK[J].Cell Death Differ,2006,13(5):730-737.

[6]Lachin J M,Genuth S,Nathan D M,et al.Effect of glycemic exposure on the risk of microvascular complications in the diabetes control and complications trial-revisited[J].Diabetes,2008,57(4):995-1001.

[7]Colette C,Monnier L.Acute glucose fluctuations and chronic sustained hyperglycemia as risk factors for cardiovascular diseases in patientswith type 2 diabetes[J].Horm Metab Res,2007,39(9):683-686.

[8]Yaqoob M,McClelland P,Patrick A W,et al.Evidence of oxidant injury and tubular damage in early diabetic nephropathy[J].QJM,1994,87(10):601-607.

[9]Nam S M,Lee M Y,Koh JH,et al.Effects of NADPH oxidase inhibitor on diabetic nephropathy in OLETF rats:the role of reducing oxidative stress in itsprotective property[J].DiabetesRes Clin Pract,2009,83(2):176-182.

[10]Weston C R,Davis R J.The JNK signal transduction pathway[J].Curr Opin Cell Biol,2007,19(2):142-149.