金建国，马作新

（1.抚顺市中医院 检验科，辽宁 抚顺 113008；2.辽宁省人民医院 检验科，辽宁 沈阳 110016）

乙型肝炎患者HBVDNA及AMA检测与肝脏纤维化相关性的研究

金建国1，马作新2

（1.抚顺市中医院 检验科，辽宁 抚顺 113008；2.辽宁省人民医院 检验科，辽宁 沈阳 110016）

目的 探讨乙肝病毒DNA（HBV DNA）、抗线粒体抗体（AMA）与肝脏纤维化之间的相关性及临床应用价值。方法采用聚合酶链反应技术检测HBV DNA；用化学发光法进行层粘连蛋白（LN）、透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原蛋白（PCⅢ）及Ⅳ型胶原蛋白（CIV）的检测；分别采用间接免疫荧光法及免疫印迹法检测抗线粒体抗体（AMA）及其M2型抗体。结果将每组的肝纤维化指标进行比较发现：HBV DNA浓度大于103copies／ml且小于105copies／ml组（A组）与HBV DNA浓度大于105copies／ml（B组）比较有统计学意义（P＜0.01）；B组与HBV DNA浓度大于105copies／ml且AMA阳性组（D组）比较有统计学意义（P＜0.01）；各组与对照组比较均有统计学意义；此外，A、C组比较无统计学意义（P＜0.05）。结论1.LN、HA、PCⅢ、CIV能够很好的反映肝纤维化进展状况，指导临床治疗。2.HBV DNA活跃复制且伴有抗线粒体阳性者较仅HBV DNA阳性者更易发生肝脏纤维化。

HBV DNA；AMA；肝脏纤维化

（ChinJLabDiagn，2012，16：0278）

我国是乙型肝炎高发区，据全国流行病学调查资料，乙肝病毒（HBV）感染率为5%－18%。慢性乙型肝炎10%－20%可发展为肝硬化，1%－5%可演变为肝癌，对人类健康危害极大［1］。慢性乙型肝炎的转归受病毒本身因素、宿主免疫因素及治疗方案等多种因素综合影响，肝组织学检查是诊断肝纤维化等肝病转归状况评价的金标准。但由于此检查属有创检查，患者依从性较差，临床上难以将肝穿刺活体组织学检查作为常规检查手段。肝纤维化血清学指标层粘连蛋白（LN）、透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原蛋白（PCⅢ）、Ⅳ型胶原蛋白（CIV）是反应肝纤维化的有效指标，且二者量化关系较好，使医生在无肝组织学检查情况下用血清学指标来推断肝组织的纤维化程度成为可能。此外，据报道，另一种可致肝纤维化的疾病——原发性胆汁性肝硬化（PBC）的发病率约为（2－24）／10万，年发病率约为（0.4－3）／10万，而且呈逐年增长的均势［2］。而在PBC的诊断中，抗线粒体抗体（AMA）是一个很有价值的指标，95%以上的PBC病人可以检测到AMA，尤其是AMA-M2，但是，在正常人群中也可检测到低滴度的AMA，而在靶细胞——胆管内皮细胞中靶抗原的表达与mRNA的表达不平行，所以，迄今为止还没有证据表明AMA是真正的自身抗体或是与细菌、病毒或外源生物相关抗原交叉反应的抗体［3］。在临床标本中也会经常检测到低滴度的AMA，尤其在乙肝阳性的一些患者中，为探讨HBV DNA、AMA与肝纤维化进展程度是否存在一定的相关性，我们进行了如下的研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 标本来源 256例来自我院2006年至2008年门诊及住院患者标本。根据其HBVDNA浓度及AMA荧光表现进行分组：A组为117例1×103copies／ml＜HBVDNA＜1×105copies／ml及AMA阴性乙肝患者；B组为HBV DNA＞1×105copies／ml的83例患者；C组为32例1×103copies／ml＜HBV DNA＜1×105copies／ml且AMA阳性滴度在1∶100与1∶320之间的患者；D组为 HBV DNA＞1×105copies／ml且AMA阳性滴度同样在1∶100与1∶320之间的24例患者；另设健康对照组为30例健康体检合格者。

1.1.2 主要仪器 Roche公司生产的lightcycler荧光定量PCR仪；北京源德生物医学工程有限公司生产的 YDME JETLIA-962型化学发光仪；OLYMPUS的BX50荧光显微镜；上海科华公司的KHB ST-360型酶标仪。

1.1.3 主要试剂 深圳匹基公司的荧光定量PCR试剂盒；北京源德公司的肝纤维化四项试剂包括LN、PⅢNP、IVC、HA试剂盒；德国欧蒙公司抗核抗体检测试剂及AMA-M2的检测试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 HBVDNA的检测 按试剂盒说明书操作。

1.2.2 肝纤四项检测 a IV 型胶原、PIIINP、LN检测：利用化学发光双抗体夹心法原理检测人体血清中IV型胶原、PIIINP、LN的含量。b血清中HA检测：利用化学发光竞争法原理检测人体血清中HA的含量。

1.2.3 免疫印迹法检测AMA-M2 按试剂盒说明书操作。

1.3 统计学方法

2 结果

对不同组别的标本分别进行 HA、PCⅢ、IVC及LN等4项肝纤维化指标的检测，所测结果见表1。所测四项肝纤指标的正常参考范围分别为：LN＜130ng／ml、PCⅢ＜120ng／ml、IVC＜120ng／ml、HA＜120ng／ml健康对照组各项指标均在参考范围内，其余4组均有不同程度的增高。对其进行统计学分析表明：A、B组比较（P＜0.01）差异有统计学意义；B、D组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；各组与对照组比较均有显著差异（P＜0.01）；此外，A、C组进行比较无统计学意义（P＞0.05）。其中C、D组均存在低滴度的AMA阳性，同样也对其进行了进一步的免疫印迹检测，仅个别几例患者检出抗线粒体M2型抗体弱阳生，由于样本例数较少未进行统计学分析，只提示个别病例有进一步发展为原发性胆汁性肝硬化（PBC）的可能。

表1 5组测试者肝纤维化检测结果

3 讨论

肝纤维化是由各种因素引起肝细胞脂肪变、坏死及炎症后，进而在坏死区发生胶原纤维增生，细胞外基质过度增生和沉积而形成。目前能反映肝纤维化的指标较多，临床中应用HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C较多。HA是一种蛋白多糖，是构成肝细胞外基质的主要成分之一，可被肝窦内皮细胞摄取、降解，肝细胞受损可影响内皮细胞功能，使血清HA含量升高；LN是主要的基底膜糖蛋白，在肝纤维化发展过程中，LN沉积于Dissee空隙，用于形成完整的内皮细胞基底膜，实验研究发现［4］，其与肝纤维化形成有重要关系，是门脉高压发生的主要基础，血清LN水平常与IV-C、HA相平行；IV-C组成肝内皮细胞与肝细胞之间的功能性基底膜，肝纤维化时基底膜的形成和破坏均增加，致使血清IV-C水平升高。细胞外基质主要以胶原蛋白为基本结构，肝纤维化时胶原细胞增生和活化，Ⅲ型胶原合成增加，导致血清PCⅢ水平升高。

本研究显示，HBV DNA＞1×105copies／ml组（B组）较之DNA浓度介于103及105cipies／ml的A组，更易于发生肝纤维化（P＜0.01），说明了病毒的活跃复制对肝病的进程有所影响；而另一合并有抗线粒体抗体且HBV DNA大于105cipies／ml的D组与B组比较起来更促进了疾病的发展（P＜0.01）；但同样是病毒的低复制状态的 A、C组，AMA的存在就未对肝纤维化程度有所影响，这也说明了低滴度抗线粒体对不同病毒复制状态的组群影响是不一致的，有待于对大样本分析。

对于与慢性乙型肝炎殊途同归即同样可导致肝纤维化，进一步发展为肝硬化的疾病——PBC，AMA抗体在其诊断中所起的作用也同样受到研究人员的关注。2000年美国肝病学会PBC诊断指导建议［5］诊断标准为：（1）碱性磷酸酶等反映胆汁瘀积的生化指标升高；（2）B超或胆管造影示胆管正常；（3）抗线粒体抗体或 AMA-M2阳性；（4）若血清AMA或AMA-M2阴性，病理检查需符合PBC改变。因此从这一标准看来，本文所选病例均非原发性胆汁性肝硬化，至多数年后发展为PBC的可能性要大些，但在促进肝病的发展中却起到了一定的作用，这可能与其免疫机制相关。抗线粒体抗体存在9种亚型，其中主要的相关抗原有丙酮酸脱氢酶E2亚基（PDC-E2）。2-氧戊二酸脱氢酶复合体（OGDC）、支链2-氧酸脱氢酶复合体的E2亚基、亚硫酸盐氧化酶及糖原磷酸化酶等，所以若存在抗线粒体抗体可对肝脏的氧化磷酸化过程有一定影响，存在着促进肝纤维化的可能。

此外，TNF-α可以诱导 TNF、IL-1及IL-6的产生，增加HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原表达，促进B、T细胞增殖及免疫球蛋白的合成，具有广泛的诱导炎症和免疫调节功能，据报道［6］AMA的存在可使TNF-α在体外生成减少，提示其为病毒大量复制提供了一定的免疫学条件；IL-10由Th2型CD4＋T细胞分泌，是一个重要的抑制因子，能够调控前炎Th1细胞反应的诱导，因此IL-10在维持自身免疫耐受性中具有重要作用，抗线粒体抗体与Th1细胞有关，IL-10分泌的下降可导致耐受下降、自身反应Th1型CD4＋T细胞异常激活，这也使C组与对照组之间比较存在着显著性差异（P＜0.01）。

成熟的CD8T淋巴细胞是清除HBV的主要效应细胞，CD8T淋巴细胞删除可导致持续性HBV感染［7］。由于急性乙型肝炎（AHB）患者 体内存在强烈而多特异的CTL反应，因此能彻底清除体内的HBV，使AHB患者完全康复。相反，在慢性肝炎患者中，抗病毒的免疫反应太弱而不足以控制和清除病毒，相反却能触发并维持持续的坏死性炎症，使细胞内部抗原持续暴露也是产生AMA的一个诱因之一，肝细胞在不断坏死不断修复中也促进了纤维化的进程。

据研究［8］，CD4＋CD25＋调节性 T细胞是一群专职的主动抑制针对自身抗原或外来抗原的免疫反应T淋巴细胞。其特点是特异性地表达FoxP3（forkhead／winged helix transcription factor）。在CHB状态下，Treg影响了针对病原的特异性细胞免疫功能，最终可能影响疾病进程。近期发现，Treg可抑制HBV抗原介导的自体PBMC增殖，反映出可能有HBV抗原特异性Treg的产生，删除Treg后可增强HBV特异性T淋巴细胞的功能［9］。因此Treg的上调也降低了对AMA的反应，研究表明，Treg细胞在整个HBV感染所导致的免疫反应中发挥了重要作用。随着HBV感染进程的发展，一方面Treg抑制效应性T细胞的数量和功能，另一方面，不论是外周血Treg频率，还是肝组织浸润的Treg细胞绝对数量均逐渐增加，并且与病毒复制向慢性肝炎、肝硬化、肝癌的发展以及患者的生存时间相关［10］。所以从这些因素也可以在一定程度上解释在病毒活跃复制及AMA阳性病例中肝纤维化指标显著升高的原由。

1979年首次完成HBV DNA的克隆化之后，随着对更多的HBV DNA全基因或基因片段的克隆和序列分析，发现不同患者感染的HBV DNA序列存在差别，而且不同基因序列的HBV感染机体后产生的抗体应答的性质也存在显著的差别，因此，根据HBV感染之后抗体应答性质的差别，将HBV分成不同的血清型（serotype）；根据HBV DNA基因序列的不同，将 HBV分成不同的基因型（genotype）。实际上，每一个患者血清中都存在大量拷贝的HBV，每一拷贝的HBV DNA序列不尽相同，表现出准种（quasispecies）的特点［11，12］。准种的概念强调的是遗传学特点高度相关又有不同，同时在自身和外界因素的影响下优势和劣势种群的构成又处于不断变化之中［13］。在一部分HBV DNA低滴度及高复制的乙肝患者血清中所检测到的AMA也可能是HBV某一准种的交叉抗体，在HBV DNA低复制状态中AMA的协同作用有可能未对肝纤维化进程有所影响，所以表现出A、C两组比较未见统计学意义（P＞0.05）。

肝纤维化及早期肝硬化可逆转，其中早期肝硬化经治疗逆转率达75%，故早期诊断对延缓肝硬化病程，甚至逆转起重要作用。研究显示［14］，HA随着慢性肝炎病程的进展而逐渐升高，尤其在慢性肝炎重度阶段和肝硬化时升高最为显著，是判断肝纤维化程度的敏感指标；血清PCⅢ在慢性肝炎加重阶段合成最活跃，但在肝硬化阶段PCⅢ合成减慢［16］；CⅣ与HA在肝纤维化发展病程中有很好的相关性，能较好地反映肝纤维化早期病变，另外，血清LN对晚期肝纤维化程度及肝硬化的诊断意义较大［14］。本研究也表明，各实验组，此四项肝纤维化指标与健康对照组比较均有统计学意义（P＜0.01），只是升高的程度有所不同，所以在病程初期就应积极用药，对D组的情况应动态检测其对治疗的反应程度，以调整用药的种类及剂量。

抗病毒治疗是目前对慢性HBV感染的主要治疗措施。当前主要有5种治疗药物：IFN-α2b、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和IFN-α2a（PEGIFN）。这些药物有利于抑制HBV复制，减轻肝脏损伤和减慢疾病进展。此外抗病毒治疗还可部分地纠正HBV特异性T淋巴细胞的低反应性，但不能诱导免疫系统的完全恢复［17］。对于A、B组类的HBV患者，如果及早的进行了抗病毒治疗来干预疾病的进程，对控制肝纤维化的发展还应是大有裨益的，对于不多见的B、D组类患者，应如何改进治疗方案，也为临床诊治提出了问题。目前，关于乙肝的免疫治疗已有大量研究，如体外扩增树突状细胞（DC）并经HBsAg负载后自体回输治疗乙肝有一定治疗效果，还有通过HBV治疗性蛋白疫苗治疗乙肝也起到一定疗效［18，19］。近年来，免疫重建（immune reconstitution）方法逐渐兴起［20］。免疫重建是指机体在较长时期的免疫抑制后，主动或被动受多种因素影响下逐渐解除免疫抑制，免疫功能得到恢复或重建，可以是完全重建，也可以是不完全重建，包括表型和功能重建。

综上，通过对HBV患者病毒复制状况、自身免疫情况及肝纤维化指标的联合监测，综合评价患者的疾病进程，以有效地选择相应的抗病毒药物及免疫干预措施，对控制疾病的发展、改善病患的生活质量等方面是很有价值的。

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The relativity study of HBV DNA、AMA and hepatic fibrosis for patients of hepatitisB

JINJian-guo，MAZuo-xin.（DepartmentofLaboratoryMedicine，TraditionalChineseMedicalHospitalofFushun，Fushun113008，China）

ObjectiveTo study relativity and clinical value about HBV DNA、anti-mitochondrion antibody（AMA）and hepatic fibrosis.MethodsPolymerase chain Reaction techonology is used to detect HBV DNA.Determination of LN，HA，PCⅢ and CIV is tested by chemical luminous assay.Using indirect immune fluorescent assay and immune printing assay examine AMA and its M2subtype antibody respectively.ResultsAfter comparing the results of hepatic fibrosis about every group，the following cases are analysed：the comparison between A group（Its concentration of HBV-DNA is between 1E＋3copies／ml and 1E＋5copies／ml）and B group（Its concencration of HBV-DNA is above 1E＋5copies／ml）has significant difference（P＜0.01），the comparison between B group and D group（Its concentration of HBV DNA is above 1E＋5copies／ml and Its AMA is positive）has significant difference（P＜0.01），and the comparison between each group and healthy group also has significant difference（P＜0.01），in addition ，there is no signifiant difference between group A and B（P＞0.05）.Conclusion1.The determination of LN，HA，PCⅢand CIV could reflect the process of hepatic fibrosis and direct the clinical treatment.2.It is more possible to develop hepatic fibrosis in patients who have active copoying of HBV DNA and AMA positive than that of single HBV DNA positive.

HBV DNA；AMA；hepatic fibrosis

R512.6＋2

A

1007－4287（2012）02－0278－04

2011－01－14）